Luận án Tiến sĩ: Phân lập & Khảo sát Tính chất Toxin Mới từ Nọc Bò Cạp Đen Heterometrus laoticus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VÕ ĐỖ MINH HOÀNG PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI TỪ NỌC BÒ CẠP ĐENHETEROMETRUS LAOTICUS Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 62.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỮU CƠ TP. Hồ Chí Minh – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VÕ ĐỖ MINH HOÀNG PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI TỪ NỌC BÒ CẠP ĐENHETEROMETRUS LAOTICUS Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 62.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỮU CƠ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Hoàng Ngọc Anh 2. Utkin Yuri Nikolaevich TP.

Hồ Chí Minh – 2017 VIỆN HÀM LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VÕ ĐỖ MINH HOÀNG PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT TOXIN CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI TỪ NỌC BỌ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số chuyên ngành: 62.01 Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Phản biện độc lập 1: Phản biện độc lập 2: NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. Hoàng Ngọc Anh 2. Giáo sư TSKH Utkin Yuri Nikolaevich Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: 1) Luận văn này là sản phẩm nghiên cứu của tôi.

2) Số liệu trong luận văn là trung thực. 3) Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. ii MỤC LỤC Trang phụ bìa. i Lời cam đoan.

ii Mục lục. iii Danh mục các chữ viết tắt. vi Danh mục các bảng. vii Danh mục các hình.

viii Mở đầu. Giới thiệu về bọ cạp. Phân bố và môi trường sống. Đặc điểm hình thái cơ bản.

Bọ cạp ở Việt Nam. Cấu trúc và ảnh hưởng của toxin nọc bọ cạp. Cấu trúc của toxin. Tác động và ảnh hưởng của nọc bọ cạp lên kênh vận chuyển ion.

Một số nghiên cứu về toxin có trong nọc bọ cạp. Các phương pháp cô lập và tinh chế toxin. Một số nghiên cứu nọc độc của chi Heterometrus. Ứng dụng của nọc bọ cạp.

Nghiên cứu trên thế giới. Nghiên cứu và ứng dụng nọc bọ cạp ở Việt Nam. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm. Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm. Xác định pH và hàm lượng protein trong nọc bọ cạp H. Xác định khối lượng phân tử của nọc bọ cạp H.

Cô lập toxin từ nọc bọ cạp. Xác định trình tự acid amin trong chuỗi polypeptide. Xác định trình tự acid amin của các toxin đối với chuột. Xác định cấu trúc bậc 1 của phân đoạn 5.

Khảo sát độc tính các phân đoạn độc. Khảo sát độc tính sơ bộ các phân đoạn độc lên chuột. Khảo sát độc tính sơ bộ các phân đoạn độc lên côn trùng. Xác định độc tính cấp của phân đoạn độc trên chuột.

Xác định độc tính cấp của phân đoạn độc lên côn trùng .Khảo sát sự tương tác của của các phân đoạn độc với kênh vận chuyển K+. NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN. Định danh bò cạp thu mua tại An Giang. Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm và thu hoạch nọc.

Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm. Thu nọc bọ cạp H. Khảo sát, đánh giá và phân tích nọc thô bọ cạp H. Khảo sát độ pH của nọc thô.

Phân tích hàm lượng protein tổng trong nọc thô. Phân tích nọc bọ cạp bằng sắc ký lọc gel trên gel Sephadex G50. Xác định khối lượng phân tử các phân đoạn nọc. Khảo sát độc tính của nọc bọ cạp H.

laoticus đối với chuột. Đánh giá độc tính của các phân đoạn nọc thu được trên chuột. Đánh giá độc tính cấp của các phân đoạn độc lên chuột. Phân tích thành phần phân đoạn 4.

Khảo sát độc tính của các phân đoạn peptide thứ cấp lên chuột. Tinh chế và xác định khối lượng phân tử các phân đoạn thứ cấp có độc tính. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.

Phân tách các peptide từ phân đoạn 4. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4. Khảo sát cấu trúc bậc một của các polypeptide phân đoạn 4.6 và tác động lên kênh vận chuyển K+. Khảo sát cấu trúc bậc một của các polypeptide phân đoạn 4.

Khảo sát tác động của Hetlaxin lên kênh vận chuyển K+ .Khảo sát độc tính của các phân đoạn của nọc bọ cạp H. laoticus lên dế. Kết quả khảo sát độc tính các phân đoạn nọc trên dế. Xác định độc tính cấp của phân đoạn độc lên côn trùng.

Phân tách phân đoạn 5. Khảo sát độc tính của các phân đoạn thứ cấp trên dế. Cô lập và xác định khối lượng phân tử protein của các phân đoạn thứ cấp có độc tính trên dế.83 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN .86 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 131 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT COSY Correlation spectroscopy DAD Diode-array detector DNA Deoxyribonucleic acid DQF Double quantum filtered EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid HPLC High performance liquid chromatography LD Lethal dose MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization MS Mass spectroscopy NOESY Nuclear Overhauser effect spectroscopy PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PD Protective dose SDS Sodium dodecyl sulfate TFA Trifluoroacetic acid TOF Time of flight vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.

Các đại diện của độc tố bọ cạp tác dụng lên kênh vận chuyển natri. Đại diện các nhóm độc tố kênh vận chuyển K+. Tóm tắt lập đường chuẩn định lượng protein bằng phương pháp biuret. Thông số sắc ký lỏng hiệu năng cao các phân đoạn độc thứ cấp.

Thông số quá trình sắc ký lỏng hiệu năng cao của phân đoạn 5. Dấu hiệu nhận biết sơ bộ độc tính lên chuột của các phân đoạn gây độc. Dấu hiệu nhận biết sơ bộ độc tính côn trùng của các phân đoạn gây độc. Kết quả đo mật độ quang của mẫu và chuẩn.

Khối lượng các phân đoạn nọc bọ cạp. Kết quả đo UV và nồng độ thực tế của 5 phân đoạn nọc bọ cạp. Kết quả thử độc tính trên chuột của các phân đoạn nọc. Tỷ lệ tử vong của chuột ở các liều khác nhau trong khoảng LD0 và LD100 sau 24 giờ tiêm.

Bảng tính theo phương pháp Karber – Behrens. Kết quả thử độc tính các phân đoạn thứ cấp. Khối lượng phân tử của các polypeptide tách ra. Kết quả thử độc tính trên dế của các phân đoạn nọc.

Tỷ lệ tử vong của dế ở các liều khác nhau trong khoảng LD0 và LD100 sau 24 giờ tiêm. Bảng tính theo phương pháp Karber – Behrens. Kết quả thử độc tính các phân đoạn thứ cấp trên dế. Tóm tắt quá trình phân tách phân đoạn 5 bằng HPLC.

77 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Một số loài bọ cạp đại diện các họ khác nhau. Loài bọ cạp Heterometrus laoticus Couzijn, 1981. Cấu trúc toxin ngắn của nọc bọ cạp.

Cấu trúc không gian của một số toxin tách ra từ nọc bọ cạp. Sắc ký đồ trao đổi ion của nọc bọ cạp loài Tityus serrulatatus. Sắc ký đồ sắc ký lọc gel của nọc bọ cạp Scorpio Maurus. Sắc ký đồ sắc ký hiệu năng cao của nọc bọ cạp Scorpio Maurus.

Thau nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm. Thu nọc bọ cạp H. Nguyên tắc của phương pháp Edman. Phản ứng phụ của phương pháp Edman.

Xác định trình tự các chuỗi polypeptide ngắn trong chuỗi ban đầu. Tách hai chuỗi polypeptide liên kết bằng cầu disulfide. Trọng lượng bọ cạp trong 6 tháng. Mẫu nọc thô bọ cạp H.

Lượng nọc bọ cạp thu được theo thời gian. Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng protein. Sắc ký đồ của nọc thô bọ cạp thực hiện bằng sắc ký lọc gel. Kết quả điện di 5 phân đoạn nọc so với mẫu chuẩn.

Đồ thị tỷ lệ % chuột chết theo liều dùng. Sắc ký đồ khi phân tách phân đoạn 4 bằng HPLC. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.

Khối lượng phân tử của phân đoạn 4. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.

Khối lượng phân tử của phân đoạn 4. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.8 bằng MALDI MS. Phân tích trình tự acid amin của Hetlaxin bằng khối phổ.

Xác định cấu trúc bậc 1 của Hetlaxin bằng khối phổ và phương pháp Edman. So sánh sự tương đồng của Hetlaxin với các toxin khác. Sự cạnh tranh của Hetlaxin với R-AgTx trong liên kết với kênh KcsA- Kv1.1 (A) và KcsA-Kv1. Đồ thị tỷ lệ % dế chết theo liều dùng.

Sắc ký đồ của phân đoạn 5. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.21 với các bước sóng 226 nm. Phổ MS của phân đoạn 5. Phổ MS của phân đoạn 5.

Phổ NMR của toxin 5. Cấu trúc của toxin 5. 78 ix MỞ ĐẦU Bọ cạp phân bố ở Việt Nam rộng khắp các vùng miền với số lượng tương đối lớn. Trong dân gian và y học cổ truyền đã sử dụng bọ cạp làm nguyên liệu trong một số phương pháp chữa bệnh.

Tuy nhiên, việc nghiên cứu một cách có hệ thống và khoa học về thành phần, tác dụng cũng như ứng dụng của nọc bọ cạp ở Việt Nam hiện nay còn sơ khai và chưa có nhiều kết quả. Trên thế giới hiện đã có nhiều nghiên cứu về thành phần, cấu trúc, tác dụng và ứng dụng của nọc bọ cạp nhưng vẫn còn nhiều vấn đề chưa thể giải quyết triệt để. Nọc bọ cạp là hỗn hợp các protein có tác động đối với hệ thần kinh, việc xác định cấu trúc các protein này cũng như cách thức các protein này tác động lên hệ thần kinh con người vẫn chưa được nghiên cứu triệt để và còn nhiều tiềm năng nghiên cứu cũng như ứng dụng. Từ việc xác định được cấu trúc và cơ chế tác động của nọc bọ cạp đối với hệ thần kinh con người, có thể đưa ra những phương án sử dụng nọc bọ cạp vào dược phẩm nhằm phục vụ các mục đích về y tế.

Trong nọc bọ cạp chứa nhiều các polypeptide có khả năng tác động lên các thụ thể và các kênh ion của màng tế bào bị kích thích, các loại polypeptide này đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu nhằm tạo ra các loại dược phẩm mới. Nhằm đóng góp một nguồn nguyên liệu mới và các nghiên cứu khoa học mới, hướng tới làm thuốc chữa bệnh và làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, tác giả đã tiến hành các nghiên cứu về nọc bọ cạpHeterometrus laoticusCouzijn.