Nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và độc tính của tinh dầu cây Chúc (Citrus hystrix DC.) tại An Giang

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ TRẦN CÔNG VINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM VÀ ĐỘC TÍNH CỦA TINH DẦU TRONG CÂY CHÚC (CITRUS HYSTRIX DC., RUTACEAE) Ở TỊNH BIÊN, AN GIANG Chuyên ngành: Dược lý – Dược lâm sàng Mã số: 62.CK LUẬN ÁN CHUYÊN KHOA CẤP II Người hướng dẫn khoa học PGS. PHẠM THÀNH SUÔL Cần Thơ - 2018 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận án này, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn đến: Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học của trường Đại học Y Dược Cần Thơ đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập và hoàn thành luận án. TS Phạm Văn Lình, Chủ tịch Hội đồng trường, đã giảng dạy, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học. TS Dương Xuân Chữ, Trưởng Khoa Dược, đã giảng dạy, truyền đạt những kinh nghiệm, hướng dẫn rất cụ thể các vấn đề trong nghiên cứu dược lý để tôi hoàn thành luận án.

TS Phạm Thành Suôl, Phó trưởng Khoa Dược, đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm, hướng dẫn và đồng hành trong suốt quá trình học tập và làm luận án. Thầy cô trong Hội đồng bảo vệ luận án cấp Khoa/Trường: PGS.TS Phạm Thị Tâm, PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Vân, TS Phạm Thị Tố Liên, TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, TS Phạm Hoàng Lai đã hướng dẫn, góp ý rất chân thành, xác đáng để tôi chỉnh sửa, hoàn thành luận án một cách tốt nhất có thể. ThS Nguyễn Ngọc Quỳnh, ThS Lê Thanh Vĩnh Tuyên, Liên Bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền – Thực vật, đã tạo điều kiện cho tôi được thực nghiệm, đã hướng dẫn, góp ý thiết thực về lĩnh vực nghiên cứu dược liệu. Tập thể quý thầy cô, ThS Trần Hoàng Yến, Liên bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, đã hướng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi được thực tập, nghiên cứu, đóng góp những ý kiến rất hữu ích để tôi hoàn thành luận án.

Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn các bạn sinh viên trong nhóm đề tài nghiên cứu cây Chúc đã cùng tôi đồng hành trong suốt quá trình thực hiện luận án. TRẦN CÔNG VINH iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. Cần Thơ, ngày 30 tháng 10 năm 2018 Trần Công Vinh iv MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Nghiên cứu về cây Chúc và tinh dầu Chúc. Tổng quan về cây Chúc. Tổng quan về tinh dầu Chúc.

Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của tinh dầu vỏ quả. Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn. Nghiên cứu tác dụng kháng nấm. Nghiên cứu về độc tính của thuốc.

Một số khái niệm liên quan. Thử nghiệm độc tính cấp. Thử nghiệm độc tính bán trường diễn. Thử nghiệm về độc tính tại chỗ.

Nghiên cứu về tinh dầu Chúc ở Việt Nam và trên thế giới. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG P HÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu.

Xác định thành phần hóa học chính trong tinh dầu vỏ quả. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của tinh dầu vỏ quả Chúc trên môi trường nuôi cấy. Đánh giá độc tính cấp, bán trường diễn và gây kích ứng da của tinh dầu vỏ quả Chúc trên động vật. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

Thành phần hóa học chính tinh dầu được phân lập từ vỏ quả Chúc. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của tinh dầu vỏ quả Chúc trên môi trường nuôi cấy. Độc tính cấp, bán trường diễn và gây kích ứng da của tinh dầu vỏ quả Chúc trên in vivo. Độc tính cấp.

Độc tính bán trường diễn. Độc tính kích ứng da. Thành phần hóa học chính trong tinh dầu vỏ quả Chúc. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của tinh dầu vỏ quả Chúc trên môi trường nuôi cấy.

Độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và kích ứng da của tinh dầu vỏ quả Chúc. Độc tính cấp. Độc tính bán trường diễn. Độc tính kích ứng da (độc tính tại chỗ) .92 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ALD Absolute lethal dose Liều chết tuyệt đối CFU Colony forming unit Đơn vị tạo khuẩn lạc DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid ĐVTN Động vật thí nghiệm FID Flame Ionization Detector Đầu dò ion hóa ngọn lửa GC Gas Chromatography Sắc ký khí LD10 0 lethal dose 100% Liều làm chết 100% LD50 lethal dose 50% Liều làm chết 50% MHA Mueller Hinton agar Thạch Mueller Hinton Minimum Inhibitory MIC Nồng độ ức chế tối thiểu Concentration MLD Mean lethal dose Liều chết trung bình MS Mass spectrometry Khối phổ MTD Maximum tolerated dose Liều dung nạp tối đa Organization for Economic Tổ chức Hợp tác và Phát OECD Co-operation and Development triển kinh tế PE Polyethen PEG Polyethylenglycol SDA Sabouraud dextrose agar TSA Tryptic soy agar TSB Tryptic soy broth vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.

Thành phần trong vỏ quả Chúc của một số nước. Chương trình nhiệt độ trong GC-MS. Chương trình nhiệt độ trong GC-FID. Cho điểm và đánh giá mức độ kích ứng thuốc lên da.

Thời gian lưu của hỗn hợp alkan chuẩn C8 -C20. Thành phần hóa học sơ bộ của các chất trong tinh dầu vỏ quả. Định tính khả năng kháng khuẩn trên in vitro. Giá trị MIC của tinh dầu vỏ quả Chúc với vi khuẩn (%).

Kết quả định tính khả năng kháng nấm. Giá trị MIC của tinh dầu vỏ quả Chúc với vi nấm (%). Kết quả khảo sát độc tính cấp của tinh dầu vỏ quả Chúc. Sự thay đổi trọng lượng ở 5 lô chuột sau 28 ngày.

Sự thay đổi trọng lượng ở 5 lô chuột sau 60 ngày. Số lượng hồng cầu ở các lô sau 30 và 60 ngày. Nồng độ Hemoglobin ở các lô sau 30 và 60 ngày. Nồng độ Hematocrit ở các lô sau 30 và 60 ngày.

Số lượng bạch cầu ở các lô sau 30 và 60 ngày. Các chỉ số của từng loại bạch cầu sau 30 và 60 ngày. Tiểu cầu ở các lô sau 30 và 60 ngày. Hoạt độ ALT ở các lô sau 30 và 60 ngày.

Hoạt độ AST ở các lô sau 30 và 60 ngày. Creatinin ở các lô sau 30 và 60 ngày. Ure máu ở các lô sau 30 và 60 ngày. Kết quả độc tính kích ứng da của lô dầu oliu.

Kết quả độc tính kích ứng da của tinh dầu vỏ quả 40 mg/ml. Kết quả độc tính kích ứng da của tinh dầu vỏ quả 80 mg/ml. Kết quả độc tính kích ứng da của tinh dầu vỏ quả 120 mg/ml .68 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hình lá và quả cây Chúc thực tế và trong tài liệu.

Phổ GC-MS của các thành phần trong tinh dầu vỏ quả Chúc. Sắc ký đồ GC-FID của tinh dầu vỏ quả Chúc thêm chuẩn nội. Sắc ký đồ GC-FID của mẫu hỗn hợp chuẩn thêm chuẩn nội .50 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam, chính sách quốc gia về thuốc và định hướng chiến lược chăm sóc sức khỏe nhân dân giai đoạn 2000 – 2020 có yêu cầu “phát huy, thừa kế có chọn lọc, đánh giá tính an toàn, hiệu lực của thuốc đồng thời hiện đại hoá dạng bào chế từ thuốc cổ truyền để sử dụng rộng rãi trong cộng đồng” [33]. Vì thế, để phát huy và thừa kế có chọn lọc các cây thuốc, bài thuốc cổ truyền, đặc biệt là cây thuốc chứa tinh dầu có tính kháng khuẩn.

So với các kháng sinh tổng hợp thì các chất kháng khuẩn từ thực vật có tiềm năng lớn vì hợp chất thiên nhiên thường an toàn và kinh tế hơn trong sử dụng. Mặt khác, cao chiết hoặc một số tinh dầu từ thực vật đã được chứng minh có hoạt tính chống lại vi khuẩn, vi nấm; gần đây tác dụng kháng khuẩn của chúng đã được quan tâm và ứng dụng trong nhiều sản phẩm thuốc. Cây Chúc còn gọi là cây trấp (chấp, giấp) có tên khoa học là Citrus hystrix DC., thuộc họ Cam (Rutaceae), là loài cây mọc hoang và được trồng nhiều nước trên thế giới. Ở nước ta, cây Chúc mọc hoang và cũng được trồng nhiều nơi, đặc biệt tại tỉnh An Giang.

Tuy nhiên, cây Chúc chưa được triển khai trồng trọt hay sử dụng ở quy mô lớn. Cây Chúc từ lâu đã được người dân biết như là một loài cây có nhiều công dụng: quả thường dùng để gội đầu [10]. Toàn cây có tinh dầu rất thơm nên được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, trong đó bộ phận được sử dụng nhiều nhất trên cây là lá và quả. Cây Chúc cũng là một phần quan trọng trong các món ăn của Thái Lan, Campuchia, Indonesia, Lào, Malaysia và Philippines.

Theo kết quả của một số công trình nghiên cứu khoa học, tinh dầu Chúc được sử dụng làm chất tạo mùi vị, được sử dụng trong nước hoa và các chế phẩm thuốc. Tinh dầu Chúc được ghi nhận có hiệu quả chống lại 20 mẫu huyết thanh có Salmonella và 5 loại vi khuẩn đường ruột khác [51]; tinh 2 dầu ở lá và ở vỏ quả có tác dụng ức chế chống lại tác nhân gây bệnh đường hô hấp [68]. Trồng, bảo vệ rừng và trồng cây dược liệu thuộc danh mục lĩnh vực đặc biệt ưu đãi trong đầu tư nông nghiệp, nông thôn của Chính phủ [32]; An Giang với diện tích các loại cây trồng hằng năm 707.247 ha, giá trị sản xuất nông nghiệp trồng trọt là 31.242 tỷ đồng/năm [14], rất phù hợp để phát triển mạnh nền nông nghiệp. Để phát huy và thừa kế có chọn lọc các cây thuốc, bài thuốc cổ truyền thì việc nghiên cứu dạng bào chế thuận tiện được sử dụng trong thực tế là rất cần thiết.

Việc tiêu chuẩn hoá chất lượng, đánh giá độ ổn định, tính an toàn và hiệu quả điều trị của một thuốc (vừa giữ được tác dụng của cây thuốc và vừa đáp ứng được các yêu cầu chất lượng của dạng thuốc) là điều không hề dễ dàng. Nhằm nâng cao hiệu quả điều trị, phục vụ rộng rãi cho nhu cầu phòng và chữa bệnh thì việc nghiên cứu những cây thuốc có tác dụng sinh học là yêu cầu cấp thiết, là cơ sở khoa học để bảo tồn và phát triển những vốn quý của nền Y Dược học cổ truyền Việt Nam. Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và độc tính của tinh dầu trong cây Chúc (Citrus hystrix DC.