Luận án tổng hợp & khảo sát hoạt tính sinh học alphitonin, maesopsin - NCS. Diệp Thị Lan Phương

Hợp chất auronol là sản phẩm chuyển hóa bậc hai của thực vật. Phân tử gồm nhân benzofuranone liên kết với nhóm phenyl. Nhóm hydroxyl gắn tại vị trí C-2 tạo nên tính chất đặc thù. Trạng thái oxy hóa cao làm tăng độ bền liên kết nội phân tử. Các auronol tự nhiên thường tồn tại ở dạng tự do hoặc liên kết glycoside. Cây họ Dâu tằm và họ Táo ta chứa một số dẫn xuất tiêu biểu. Alphitonin và maesopsin là hai đại diện tiêu biểu nhất của nhóm này. Đặc tính hóa lý phụ thuộc mạnh vào số lượng nhóm hydroxyl phenolic. Khả năng hòa tan thay đổi khi phân tử gắn thêm chuỗi đường. Dạng glycoside tan tốt trong nước, thuận lợi cho hấp thu sinh học. Việc định danh chính xác giúp sáng tỏ giá trị dược liệu cổ truyền.

Dẫn xuất aurone là tiền chất oxy hóa quan trọng tạo thành auronol. Cả hai đều thuộc lớp flavonoid có khung năm cạnh furan. Aurone có liên kết đôi ngoại vòng tại vị trí C-2. Phản ứng hydrate hóa liên kết đôi chuyển hóa aurone thành auronol tương ứng. Cấu trúc phẳng của aurone thay đổi khi tạo thành trung tâm lập thể C-2. Tính chất quang học và hoạt tính sinh học biến đổi đáng kể sau chuyển hóa. Dẫn xuất aurone thể hiện phổ kháng khuẩn và ức chế enzyme rộng. Chuyển hóa thành auronol làm tăng khả năng dập tắt gốc tự do. Mối liên hệ sinh tổng hợp định hướng cho các phản ứng hóa học nhân tạo. Nghiên cứu cơ chế chuyển hóa giúp tối ưu hóa hiệu suất tổng hợp trong phòng thí nghiệm.

Cấu trúc 2-benzyl-2-hydroxycoumaran-3-one là hạt nhân cơ bản của auronol. Khung carbon gồm dị vòng furanone ngưng tụ với vòng benzen. Vị trí C-2 là tâm bất đối xứng mang nhóm hydroxyl và nhóm benzyl. Sự hiện diện của nhóm hydroxyl C-2 chi phối độ bền hóa học. Phân tử dễ bị đồng phân hóa hoặc phân hủy trong môi trường kiềm mạnh. Cấu hình lập thể ảnh hưởng trực tiếp đến ái lực liên kết thụ thể. Phân tích cấu trúc 2-benzyl-2-hydroxycoumaran-3-one đòi hỏi kỹ thuật phổ nghiệm tiên tiến. Các nhóm thế trên hai vòng thơm thay đổi tính phân cực. Biến tính cấu trúc khung giúp mở rộng thư viện chất có hoạt tính sinh học cao.

Củ Thổ phục linh chứa hàm lượng lớn hợp chất astilbin. Dung môi cồn ethanol được dùng để chiết kiệt hoạt chất từ dược liệu thô. Dịch chiết cô đặc được xử lý qua cột sắc ký silica gel. Quá trình rửa giải sử dụng hệ dung môi phân cực tăng dần. Tinh thể astilbin thu được có màu trắng ngà và độ tinh khiết cao. Cấu trúc phân tử gồm khung taxifolin liên kết với đường rhamnose. Kỹ thuật sắc ký bản mỏng kiểm tra độ sạch của từng phân đoạn chiết. Hiệu suất phân lập đạt mức tối ưu nhờ kiểm soát tốt nhiệt độ bay hơi. Astilbin tinh chế được bảo quản khô ráo để phục vụ phản ứng tiếp theo. Nguồn nguyên liệu này đáp ứng tiêu chuẩn hóa dược cho quá trình bán tổng hợp.

Phản ứng thủy phân cắt đứt liên kết glycoside trong phân tử astilbin. Xúc tác acid vô cơ loãng được sử dụng trong môi trường cồn. Nhiệt độ phản ứng duy trì ở mức hồi lưu nhẹ để tránh phân hủy khung. Đường rhamnose bị tách ra, giải phóng phân tử dihydroflavonol tự do. Sản phẩm taxifolin kết tinh trực tiếp khi làm lạnh hỗn hợp phản ứng. Tinh thể taxifolin được lọc rửa sạch bằng nước cất và sấy chân không. Hiệu suất phản ứng thủy phân đạt trên 85% trọng lượng lý thuyết. Độ tinh sạch của taxifolin được kiểm định bằng phương pháp HPLC. Tiền chất này giữ vai trò then chốt cho bước chuyển vị tiếp theo. Quy trình thủy phân thực hiện đơn giản và thân thiện với môi trường.

Taxifolin trải qua phản ứng chuyển vị mở vòng và tái đóng vòng. Dung dịch kiềm nhẹ thúc đẩy quá trình đồng phân hóa nội phân tử. Phản ứng biến đổi khung flavanonol sáu cạnh thành khung furan năm cạnh. Sản phẩm tạo thành chính là alphitonin mang cấu trúc auronol đặc trưng. Đây là dạng flavonoid tự nhiên có hoạt tính sinh học vượt trội. Phản ứng kết thúc khi kiểm tra sắc ký không còn vết taxifolin. Axit hóa nhẹ dung dịch để kết tủa hoàn toàn hợp chất mục tiêu. Sản phẩm thô được tinh chế lại qua cột sắc ký pha đảo. Hiệu suất chuyển hóa đạt mức cao và sản phẩm có độ tinh khiết quang học tốt. Quy trình khẳng định con đường sinh tổng hợp giả định trong thực vật.

Tổng hợp tiền chất là giai đoạn đầu tiên của quy trình hóa học. Phản ứng Friedel-Crafts hoặc Houben-Hoesch tạo ra khung benzofuranone thích hợp. Phloroglucinol hoặc resorcinol được ngưng tụ với dẫn xuất chloroacetonitrile. Tiếp theo, phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt tạo ra khung chalcone tương ứng. Aldehyde thơm mang các nhóm thế bảo vệ phản ứng với acetophenone. Dung dịch kiềm làm xúc tác thúc đẩy phản ứng ngưng tụ tạo liên kết C-C. Các tiền chất thu được qua lọc và kết tinh lại trong dung môi thích hợp. Kiểm tra phổ xác nhận độ sạch của từng chất trung gian. Độ tinh khiết của tiền chất quyết định trực tiếp đến hiệu suất các bước kế tiếp. Quy trình tổng hợp tiền chất đạt độ lặp lại cao và ổn định.

Quá trình tổng hợp toàn phần alphitonin tiến hành qua bước oxy hóa đóng vòng. Tiền chất chalcone được xử lý bằng tác nhân oxy hóa thích hợp. Phản ứng tạo trung gian epoxide hoặc chuyển vị tạo khung aurone. Tiếp tục hydrat hóa chọn lọc đưa nhóm hydroxyl vào vị trí C-2 của khung. Bước khử bảo vệ giải phóng các nhóm hydroxyl phenolic tự do trên vòng thơm. Tác nhân khử chọn lọc bảo toàn khung heterocycle nhạy cảm. Sản phẩm alphitonin kết tinh dưới dạng bột màu vàng nhạt. Phương pháp tinh chế bằng sắc ký cột loại bỏ hoàn toàn sản phẩm phụ. Hiệu suất tổng thể của quy trình tổng hợp đạt mức ấn tượng. Sản phẩm đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn chất lượng của một hợp chất đối chứng chuẩn.

Quy trình tổng hợp hóa học maesopsin xuất phát từ tiền chất 4,6-dihydroxybenzofuran-3-one. Hợp chất ngưng tụ với 4-hydroxybenzaldehyde đã được bảo vệ nhóm thế. Phản ứng tạo dẫn xuất aurone trung gian với hiệu suất trên 80%. Bước tiếp theo là phản ứng epoxid hóa hoặc oxy hóa trong môi trường kiểm soát. Quá trình hydrat hóa xúc tác acid mở vòng oxirane tạo khung auronol. Khử bỏ nhóm bảo vệ benzyl hoặc methoxymethyl thu được maesopsin tự do. Sản phẩm được kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi methanol và nước. Hợp chất thu được có độ sạch cao và phổ NMR hoàn toàn trùng khớp. Quy trình tổng hợp hóa học maesopsin này chứng minh tính ưu việt về hiệu suất và thời gian.

Thiết kế cấu trúc dựa trên mô hình tương tác phân tử với enzyme đích. Nhóm nitrile phân cực mạnh làm tăng khả năng tạo liên kết hydro liên phân tử. Dẫn xuất aurone chứa nhóm cyano đóng vai trò tiền chất biến tính quan trọng. Phản ứng ghép nhóm bromoacetonitrile lên vị trí hydroxyl phenolic được tiến hành. Tác nhân base yếu potassium carbonate được dùng để định hướng thế chọn lọc. Phản ứng diễn ra êm dịu trong dung môi dimethylformamide khan. Kiểm soát tỷ lệ mol tác nhân giúp định hướng tạo sản phẩm mong muốn. Sự hiện diện của nhóm nitrile làm thay đổi độ tan và tính chất điện tử. Dẫn xuất aurone tổng hợp được là cơ sở để chuyển hóa thành auronol tương ứng.

Quy trình tổng hợp tạo ra cả dẫn xuất mang một nhóm và hai nhóm nitrile. Dẫn xuất mono-nitrile thu được khi khống chế tỷ lệ tác nhân thế ở mức 1:1. Dẫn xuất di-nitrile hình thành khi tăng lượng tác nhân alkyl hóa lên gấp đôi. Phản ứng thế xảy ra ưu tiên tại các vị trí hydroxyl có tính acid mạnh hơn. Hỗn hợp phản ứng được phân tách triệt để bằng sắc ký cột silica gel. Dung môi rửa giải gồm n-hexane và ethyl acetate phân tách rõ rệt hai dẫn xuất. Cấu trúc của từng dẫn xuất được xác nhận chính xác bằng các phương pháp phổ. Các hợp chất mono-nitrile và di-nitrile cho thấy độ bền hóa học cao hơn phân tử gốc. Kết quả cung cấp thêm các dẫn xuất mới phục vụ sàng lọc dược lý.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR 13C-NMR khẳng định khung carbon và proton. Trên phổ 1H-NMR, tín hiệu hai proton metylen benzyl xuất hiện dạng doublet đặc trưng. Tín hiệu này chứng minh sự tồn tại của nhóm thế tại vị trí C-2. Proton hydroxyl C-2 xuất hiện ở vùng trường thấp do liên kết hydro nội phân tử. Trên phổ 13C-NMR, carbon C-2 bậc bốn xuất hiện ở độ dịch chuyển hóa học khoảng 105 ppm. Tín hiệu carbon carbonyl C-3 cộng hưởng ở vùng 195-200 ppm. Các kỹ thuật phổ 2D-NMR như HSQC và HMBC xác nhận tương tác liên kết dị nhân. Tương tác qua 3 liên kết giữa proton benzyl và C-3 khẳng định khung auronol. Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR 13C-NMR hoàn toàn khớp với lý thuyết.

Phổ khối lượng phân giải cao HR-MS xác định chính xác khối lượng phân tử. Kỹ thuật ion hóa phun sương điện tử ESI-MS tạo ion giả phân tử [M+H]+ hoặc [M-H]-. Sai số khối lượng giữa giá trị đo và giá trị lý thuyết nhỏ hơn 2 ppm. Kết quả này khẳng định công thức nguyên của alphitonin và maesopsin tổng hợp. Phổ khối lượng phân giải cao HR-MS cũng ghi nhận các mảnh ion vỡ đặc trưng. Mảnh vỡ do mất gốc benzyl hoặc phân cắt dị vòng furanone cung cấp thông tin liên kết. Sự trùng khớp về khối lượng chính xác loại bỏ hoàn toàn các cấu trúc đồng phân. Kỹ thuật HR-MS là bằng chứng không thể thiếu để công bố chất mới. Dữ liệu khẳng định độ sạch và cấu trúc phân tử tuyệt đối.

Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa DPPH ABTS đánh giá khả năng cho hydro và điện tử. Gốc tự do DPPH bị khử làm dung dịch chuyển từ màu tím sang màu vàng. Gốc tự do cation ABTS+ bị mất màu xanh lam khi gặp chất chống oxy hóa. Alphitonin và maesopsin thể hiện giá trị IC50 rất thấp trên cả hai phép thử. Hoạt tính dập tắt gốc tự do của chúng tương đương với acid ascorbic chuẩn. Cơ chế tác dụng dựa trên nhóm hydroxyl phenolic và cấu trúc polyphenol linh hoạt. Các nhóm hydroxyl cho proton trung hòa gốc tự do và tạo gốc phenoxy bền vững. Kết quả chứng minh hoạt tính chống oxy hóa DPPH ABTS mạnh mẽ của nhóm auronol. Hợp chất có tiềm năng ứng dụng bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa.

Thử nghiệm hoạt tính kháng viêm in vitro đánh giá khả năng ức chế sản sinh nitric oxide (NO). Tế bào đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bằng lipopolysaccharide (LPS). Nồng độ NO trong môi trường nuôi cấy được định lượng qua phản ứng Griess. Alphitonin và maesopsin ức chế mạnh sự phóng thích NO mà không gây độc tế bào. Dẫn xuất mono-nitrile thể hiện hoạt tính kháng viêm in vitro gia tăng rõ rệt. Cơ chế kháng viêm liên quan đến việc ức chế biểu hiện enzyme iNOS và COX-2. Các hợp chất cũng làm giảm nồng độ các cytokine gây viêm như TNF-alpha và IL-6. Kết quả khẳng định tiềm năng phát triển thuốc kháng viêm tự nhiên an toàn. Thử nghiệm mở ra hướng điều trị các bệnh viêm mãn tính hiệu quả.

Độc tính tế bào được khảo sát trên các dòng tế bào ung thư và tế bào lành. Phép thử MTT đánh giá tỷ lệ sống sót của tế bào sau thời gian ủ chất. Alphitonin và maesopsin không gây độc tế bào ở nồng độ tác dụng sinh học. Thử nghiệm kích thích tế bào lympho cho thấy khả năng điều hòa miễn dịch chọn lọc. Các hợp chất kích thích sự phân chia tế bào lympho T và lympho B có kiểm soát. Khả năng điều hòa miễn dịch giúp cơ thể tăng cường đề kháng tự nhiên. Dẫn xuất tổng hợp duy trì tính an toàn sinh học cao trên mô hình nuôi cấy. Đây là cơ sở then chốt để tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng trên động vật. Nghiên cứu khẳng định giá trị ứng dụng điều trị của nhóm chất.