Luận án tiến sĩ dược học: Nghiên cứu ứng dụng sắc ký phân tích alkaloid flavonoid lá tâm sen - Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT Mã số: 62.10 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. NGUYỄN ĐỨC TUẤN TP Hồ Chí Minh – Năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả được trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Người cam đoan, Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ i MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC.

i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT. iii DANH MỤC CÁC BẢNG. v DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ. viii MỞ ĐẦU.

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Thực vật học về Sen. Hóa học về Sen. Chiết xuất- phân lập các alkaloid, flavonoid trong lá và tâm Sen.

Các phương pháp phân tích thành phần alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen. Tác dụng sinh học của lá, tâm Sen. Công dụng của Sen. Chất đối chiếu.

22 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu. Nguyên vật liệu – Dung môi, hóa chất, thuốc thử – Trang thiết bị. Địa điểm nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá và tâm Sen.

Chiết cao chiết toàn phần alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen. Phân lập alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen. Xác định độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen. Xác định cấu trúc các chất phân lập được.

Thiết lập một số chất đối chiếu alkaloid, flavonoid phân lập từ lá, tâm Sen. Xây dựng qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid có trong lá và tâm Sen. Ứng dụng các qui trình định tính, định lượng để phân tích các alkaloid, flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen. 104 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN.

Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc cấu trúc các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen. Qui trình định tính, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid có trong lá và tâm Sen. Ứng dụng qui trình định tính, định lượng để phân tích các alkaloid, flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm từ lá, tâm Sen. Đặc tính điểm chỉ của lá và tâm Sen.

127 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitrile ASEAN Association of Southeast Asian Nations (Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á) CĐC Chất đối chiếu CE Capillary electrophoresis (Điện di mao quản) Corr Area Corrected Area (Diện tích pic được chuẩn hóa) CTAB Cetyltrimethylammonium bromide CZE Capillary Zone Electrophoresis (Điện di mao quản vùng) d doublet (đỉnh đôi) DVT Dấu vân tay DĐVN IV Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ IV DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DSC Differential Scanning Calorimetry (Quét nhiệt vi sai) DMSO Dimethylsulfoxide ĐDĐ Điện di đồ DTAB Dodecyltrimethylammonium bromide ESI Electrospray Ionization (Ion hóa phun mù electron) EOF Electro-osmotic flow (Dòng điện thẩm) FCPC Fast centrifugal partition chromatography (Sắc ký phân bố ly tâm nhanh) GLP Good Laboratory Practices (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc) HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation ICH International Conference on Harmonization IR Infrared (Hồng ngoại) i-ProOH Isopropanol iv J Coupling constant (Hằng số ghép) LC-MS Liquid Chromatography–Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng ghép khối phổ) LDL Low density lipoprotein LOD Limit of detection LOQ Limit of quantitation MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography (Sắc ký mixen điện động) MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 (Tế bào ung thư vú dòng MCF-7) MS Mass Spectrometry (Khối phổ) NACE Non aqueous capillary electrophoresis NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang) PE Petroleum ether (ether dầu hỏa) PCRS Primary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học sơ cấp) PTN Phòng thí nghiệm RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) s singlet (Đỉnh đơn) SKĐ Sắc ký đồ SCRS Secondary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học thứ cấp) SDS Sodium Dodecyl Sulfate SFE Supercritical Fluid Extraction (Chiết bằng lưu chất siêu tới hạn) SKLM Sắc ký lớp mỏng TEA Triethylamin TGA Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhiệt trọng lượng) THF Tetrahydrofuran TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến) VLC Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân không) v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Vị trí phân loại của chi Nelumbo. Các alkaloid khung aporphin có trong lá Sen. Các alkaloid khung benzylisoquinolin có trong lá Sen.

Các alkaloid khung benzylisoquinolin có trong tâm Sen. Các alkaloid khung bisbenzylisoquinolin có trong tâm Sen. Tóm tắt các nghiên cứu phân lập alkaloid, flavonoid lá, tâm Sen. Tóm tắt các nghiên cứu định lượng alkaloid, flavonoid lá và tâm Sen.

Nơi thu hái nguyên liệu lá và tâm Sen loài Nelumbo nucifera G. Nơi thu hái nguyên liệu lá Sen loài N. Lutea Willd và Victoria regia. Các chế phẩm có chứa lá và tâm Sen.

Khảo sát dung môi chiết alkaloid, flavonoid từ lá, tâm Sen. Điều kiện tiến hành VLC phân đoạn A2 và tủa F từ lá Sen. Điều kiện tiến hành sắc ký cột cao A3, cao N lá Sen. Điều kiện tiến hành sắc ký cột phân đoạn NP5, NP8, cao EF tâm Sen.

Điều kiện tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 phân đoạn F1, F6, F8. Các điều kiện dung môi hai pha không đồng tan dự kiến thăm dò cho FCPC phân đoạn P-2. Kết quả chiết cắn toàn phần từ lá, tâm Sen. Kết quả chiết alkaloid, flavonoid toàn phần từ lá, tâm Sen.

Tổng kết các alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ lá Sen. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao A2, lá Sen. Kết quả thu hứng LN-1 từ phân đoạn A2-1. Kết quả thu hứng LN-2, LN-8 từ phân đoạn A2-2.

Kết quả thu hứng LN-2, LN-3 từ phân đoạn A2-3. Kết quả thu hứng LN-4 từ phân đoạn A2-8. Kết quả thu hứng LN-6, LN-7 từ phân đoạn A2-6. Kết quả thu hứng LN-5 từ phân đoạn A2-11 và A2-12.

Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao A3 lá Sen. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao N lá Sen. Kết quả sắc ký cột silica gel trên tủa F, lá Sen. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F1.

Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-2,3. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-7. Kết quả thu hứng LF-2 và LF-4 từ F7-3. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F8.

Tổng kết các alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ lá Sen. Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP5, tâm Sen. Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP8, tâm Sen. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn P.

Kết quả FCPC phân đoạn P-2. Kết quả Sephadex LH-20 của phân đoạn n-Bu. Kết quả các phân đoạn sau SPE từ n-Bu II. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao EF, tâm Sen.

Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn EF-8, tâm Sen. Độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen. Dữ liệu phổ UV, MS của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4. Dữ liệu phổ 13C- NMR của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4.

Dữ liệu phổ 1H- NMR của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4. Dữ liệu phổ 13C và 1H-NMR của LN-5. Dữ liệu phổ UV, MS của LN-8, LN-9. Dữ liệu phổ 13C và 1H- NMR của LN-8, LN-9.

Dữ liệu phổ UV, IR, MS của EN-1, EN-2, EN-3. Dữ liệu phổ 13C và 1H- NMR của EN-1, EN-2, EN-3. Dữ liệu phổ UV, IR, MS của các alkaloid EN-4, EN-5. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của EN-4.

Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của EN-5. Dữ liệu phổ UV, IR, MS của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9. Dữ liệu phổ 13C-NMR của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9. Dữ liệu phổ 1H-NMR của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9.

Dữ liệu phổ UV, MS của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1. Dữ liệu phổ 13C-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1. Dữ liệu phổ 1H-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1. Dữ liệu phổ UV, MS của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3.

Dữ liệu phổ 13C-NMR của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3. Dữ liệu phổ 1H-NMR của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3. Kết quả khảo sát hàm ẩm bằng phương pháp TGA và nhiệt độ nóng chảy, độ tinh khiết bằng phương pháp DSC (n=3). Bảng tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết HPLC-PDA của 06 CĐC.

Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC của 06 CĐC. Kết quả xác định miền giá trị, độ đúng, độ chính xác của qui trình phân tích các nguyên liệu thiết lập CĐC. Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký các nguyên liệu thiết lập CĐC. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng và phương pháp thử của các CĐC.

Kết quả đánh giá đồng nhất lô của quá trình đóng lọ các CĐC. Kết quả đánh giá liên PTN của các nguyên liệu thiết lập CĐC. Kết quả xác định giá trị ấn định của các CĐC sau khi đóng gói .58 Kết quả khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian, độ đúng qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid trong mẫu nguyên liệu lá sen (NN-1a) bằng phương pháp CE-PDA/MS. Kết quả khảo sát đặc tính điểm chỉ các alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen bằng phương pháp SKLM.

Kết quả khảo sát đặc tính điểm chỉ các alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen bằng phương pháp SKLM. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC-PDA. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC/PDA. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần alkaloid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA .