Luận án TS Nguyễn Thị Thoa: Định tính, định lượng hoạt chất Hà thủ ô đỏ HPLC

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNBERG) HARALDSON BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội - 2021 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNBERG) HARALDSON BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 9.14 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Nguyễn Tiến Đạt 2. Nguyễn Hải Đăng Hà Nội - 2021 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Tiến Đạt và TS.

Nguyễn Hải Đăng. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 16 tháng 02 năm 2021 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thoa iv LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài VAST. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.

Tôi xin bảy tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng tới PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt và TS. Nguyễn Hải Đăng - những người thầy đã tận tâm hướng dẫn, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển cùng tập thể cán bộ của Viện đã quan tâm giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Hoạt chất sinh học, Trung tâm tiên tiến về Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa sinh biển đã tạo điều kiện cơ sở vật chất, trang thiết bị tốt nhất để tôi thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ hóa và đồng nghiệp đã giúp đỡ, luôn tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi học tập và thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới toàn thể gia đình, bạn bè và người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án.

Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Nguyễn Thị Thoa v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. iv MỤC LỤC. v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.viii DANH MỤC BẢNG. xi DANH MỤC HÌNH.

xiii MỞ ĐẦU. Giới thiệu chi Fallopia. Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ. Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ trên thế giới.

Các nghiên cứu về thành phần hóa học. Hợp chất stilbene. Hợp chất quinone. Hợp chất flavonoid.

Hợp chất lipid. Một số hợp chất khác. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học. Các nghiên cứu về khả năng gây độc gan của hà thủ ô đỏ.

Các nghiên cứu về phân tích định tính, định lượng hoạt chất của hà thủ ô đỏ. Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ tại Việt Nam. Tổng quan về thẩm định phương pháp phân tích. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.

Đối tượng nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp phân lập các hợp chất. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất.

Phương pháp xử lí mẫu. Phương pháp phân tích định tính, định lượng các hợp chất. Phân lập các hợp chất. Hằng số vật lí và các dữ kiện phổ của các hợp chất.

Hợp chất FM3. Hợp chất FM4. Hợp chất FM1. Hợp chất FM2.

Hợp chất FM5. Hợp chất FM6. Hợp chất FM7. Hợp chất FM8.

Hợp chất FM9. Hợp chất FM10. Hợp chất FM11. Kết quả thiết lập điều kiện phân tích cho hệ thống HPLC.

Kết quả khảo sát thể tích bơm mẫu. Kết quả lựa chọn cột sắc ký. Kết quả khảo sát bước sóng phân tích. Kết quả khảo sát pha động.

Kết quả khảo sát thời gian lưu và độ tinh khiết của các chất tham chiếu 43 2. Kết quả khảo sát hệ thống LC/MS. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng. Quy trình xử lí mẫu phân tích.

Kết quả thẩm định phương pháp định tính, định lượng. Kết quả xác định tính chọn lọc của phương pháp. Kết quả xác định LOD, LOQ. Kết quả xác định độ chụm.

Kết quả xác định độ lặp. Kết quả xác định độ tái lặp. Kết quả xác định độ đúng. Kết quả phân tích mẫu.

THẢO LUẬN KẾT QUẢ. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ hà thủ ô đỏ. Hợp chất FM3. Hợp chất FM4.

Hợp chất FM1. Hợp chất FM2. Hợp chất FM5. Hợp chất FM6.

Hợp chất FM7. Hợp chất FM8. Hợp chất FM9. Hợp chất FM10.

Hợp chất FM11. Thiết lập quy trình định tính, định lượng hoạt chất trong hà thủ ô đỏ. Hàm lượng hoạt chất trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ. Sắc ký đồ DAD 280 nm của 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.

Sắc ký đồ DAD 320 nm của 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ. Sắc ký đồ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang. Kết quả phân tích 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.120 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ. 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

Error! Bookmark not defined. viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải 1 H-NMR Proton nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ proton resonance spectroscopy 13 C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ carbon-13 resonance spectroscopy AOAC Association of Official Hiệp hội các nhà hóa phân Analytical Chemists tích chính thức ASTM American Society for Testing Hiệp hội xét nghiệm nguyên of Materials vật liệu Mỹ CC Column chromatography Sắc ký cột CL Chemiluminescence Phổ phát quang hóa 1 1 COSY H- H Correlation Phổ COSY spectroscopy DAD Diod array detector Detector mảng diode DEPT Distortionless enhancement Phổ DEPT by polarisation transfer DMSO Dimethylsulfoxide (CH3)2SO EC50 Half maximal effective Nồng độ hiệu quả trung bình concentration ESI-MS Electron spray ionization Phổ khối lượng phun mù điện mass spectrum tử GI50 The average growth inhibition Ức chế tăng trưởng trung bình of 50% 50% HPLC High performance liquid Sắc kí lỏng hiệu năng cao chromatography ix HR-MS High resolution - mass Phổ khối lượng phân giải cao spectrum HMBC Heteronuclear multiple bond Phổ HMBC connectivity HSQC Heteronuclear single-quantum Phổ HSQC coherence IC50 Inhibitory concentration at Nồng độ ức chế 50% đối 50% tượng thử nghiệm ICH International Conference on Hội đồng hòa hợp quốc tế Harmonization ISO International Standard Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế Organization LC/MS Liquid chromatography Sắc ký lỏng khối phổ mass spectrometry LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng MCF-7 Human breast carcinoma Ung thư vú ở người MS Mass spectrum Phổ khối lượng NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân spectroscopy NOESY Nuclear overhauser Phổ NOESY enhancement spectroscopy PAD Photodiode array detection Detector mảng diode RP Reverse phase Pha đảo RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối x S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SW620 Ung thư ruột kết TCVN - Tiêu chuẩn Việt Nam THSG 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene- - 2-O-β-D-glucoside TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethyl silan (CH3)4Si UPLC Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu năng chromatography UHPLC-MS/MS Ultra high performance liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu năng chromatography-mass cao kết nối hai lần khối phổ spectrum/mass spectrum USFDA United States Food and Cục dược phẩm và thực phẩm Drug Administration Mỹ USP United States Pharmacopoeia Dược điển Mỹ UV Ultraviolet Tử ngoại YMC-RP YMC-reversed phase Pha đảo YMC xi DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Các hợp chất stilbene phân lập từ hà thủ ô đỏ. Các hợp chất quinone phân lập từ hà thủ ô đỏ.

Các hợp chất flavonoid phân lập từ hà thủ ô đỏ. Các hợp chất lipid phân lập từ hà thủ ô đỏ. Một số hợp chất khác phân lập từ hà thủ ô đỏ. Điều kiện chiết và chỉ tiêu định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ ở một số Dược điển.

Bảng thông tin nguồn gốc và ký hiệu mẫu nghiên cứu. Bước sóng hấp thụ cực đại của các chất tham chiếu. Kết quả thời gian lưu và độ tinh khiết các chất tham chiếu. Pic ion giả phân tử giả phân tử và thời gian lưu các chất tham chiếu trên hệ thống LC/MS.

Bảng nồng độ dung dịch lập đường chuẩn định lượng. Kết quả phương trình đường chuẩn định lượng bảy hợp chất. Kết quả xác định LOD và LOQ. Kết quả xác định độ lặp của phương pháp (đối với FM2).

Kết quả xác định độ lặp của phương pháp (đối với FM4). Kết quả xác định độ lặp của phương pháp (đối với FM5). Kết quả xác định độ lặp của phương pháp (đối với FM3). Kết quả xác định độ lặp của phương pháp (đối với FM8).

Kết quả xác định độ lặp của phương pháp (đối với FM6). Kết quả xác định độ lặp của phương pháp (đối với FM1). Kết quả xác định độ tái lặp của phương pháp. Kết quả xác định độ thu hồi trên mẫu thực hợp chất FM2.

Kết quả xác định độ thu hồi trên mẫu thực hợp chất FM4. Kết quả xác định độ thu hồi trên mẫu thực hợp chất FM5. Kết quả xác định độ thu hồi trên mẫu thực hợp chất FM3. Kết quả xác định độ thu hồi trên mẫu thực hợp chất FM8.

Kết quả xác định độ thu hồi trên mẫu thực hợp chất FM6. Kết quả xác định độ thu hồi trên mẫu thực hợp chất FM1. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM2 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM4 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.

Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM5 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM3 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM8 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM6 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.

Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM1 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.