Luận án tiến sĩ: Đánh giá hoạt tính kháng phân bào của cao chiết nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004 trên dòng tế bào MCF-7, Jurkat T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN CHÍ DŨNG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ MCF-7, JURKAT T CỦA CAO CHIẾT VÀ HOẠT CHẤT TỪ SINH KHỐI, QUẢ THỂ NHÂN NUÔI CỦA CHỦNG NẤM Cordyceps neovolkiana DL0004 VÀ Isaria cicadae F0004 LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN CHÍ DŨNG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ MCF-7, JURKAT T CỦA CAO CHIẾT VÀ HOẠT CHẤT TỪ SINH KHỐI, QUẢ THỂ NHÂN NUÔI CỦA CHỦNG NẤM Cordyceps neovolkiana DL0004 VÀ Isaria cicadae F0004 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Ngô Kế Sương 2. Đinh Minh Hiệp Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận án tiến sỹ ngành Công nghệ Sinh học, với đề tài “Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7, Jurkat T của cao chiết và hoạt chất từ sinh khối, quả thể nhân nuôi của chủng nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004” là công trình khoa học do Tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. Ngô Kế Sương và TS.

Đinh Minh Hiệp. Những kết quả nghiên cứu của luận án hoàn toàn trung thực và chính xác. NGHIÊN CỨU SINH Nguyễn Chí Dũng i LỜI CẢM ƠN Tôi chân thành kính trọng và biết ơn những người Thầy, Cô, Anh, Chị, đồng nghiệp, đồng môn, gia đình và bạn bè đã giúp đỡ Tôi rất nhiều cả trong học vấn cũng như cuộc sống hằng ngày trước và trong quá trình làm luận án tiến sỹ công nghệ sinh học này. Với tất cả sự chân thành, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thực nhất đến: Phó Giáo sư, Tiến sỹ Khoa học Ngô Kế Sương đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu, trong công việc và cuộc sống.

Tiến sỹ Đinh Minh Hiệp đã luôn động viên và hướng dẫn kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu cũng như giúp đỡ nhiệt tình những lúc Tôi gặp khó khăn. Tiến sỹ Nguyễn Thị Mỹ Nương, Tiến sỹ Dương Thúc Huy và Tiến Sỹ Đặng Hoàng Phú đã luôn hỗ trợ tư vấn giúp đỡ các vấn đề liên quan Luận án. Thầy cô, nhà khoa học tại Viện Sinh học nhiệt đới và Học viện khoa học và công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ đã tận tụy dạy dỗ trong những năm tôi tham gia chương trình nghiên cứu sinh tại Học viện. Tập thể các bạn học viên, sinh viên, nghiên cứu sinh nhóm Cordyceps, đặc biệt là các Em Vũ Thị Ngân, Trần Tài, Huỳnh Thư, Nguyễn Tài Hoàng, Trần Minh Trang, Nguyễn Hoàng Đăng Khoa, Phạm Thị Mỹ Ninh, Hà Thị Ngọc, Nguyễn Nguyệt Hồng, Mai Kiều Tiên và Hà Thị Bích Hằng đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận án.

Cuối cùng, nhưng rất quan trọng, Tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Gia đình, bạn bè luôn hỗ trợ và động viên để Tôi vượt qua khó khăn trong suốt quá trình học tập, là nguồn động lực to lớn để tôi có thể hoàn thành tốt Luận án tiến sỹ. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 09 năm 2022 NGHIÊN CỨU SINH Nguyễn Chí Dũng ii Trang LỜI CAM ĐOAN. ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT. vi DANH MỤC CÁC BẢNG.

ix DANH MỤC CÁC HÌNH. Tổng quan về nấm Cordyceps. Giới thiệu về nấm Cordyceps. Tổng quan về Cordyceps neovolkiana và Isaria cicadae.

Giá trị kinh tế của nấm Cordyceps. Nghiên cứu nuôi cấy Cordyceps. Thành phần hoạt chất và hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps. Thành phần hoạt chất của Cordyceps.

Hoạt tính kháng phân bào của Cordyceps. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP. Vật liệu nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu.

Dụng cụ và thiết bị. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp thu nhận cao chiết và các hợp chất. Phương pháp khảo sát hoạt tính gây độc tế bào và cảm ứng apoptosis của cao chiết và các hợp chất.

Phương pháp xử lý số liệu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Chiết cao từ sinh khối và quả thể C. neovolkiana DL0004 và I.

Hoạt tính gây độc tế bào của các cao chiết với dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T. Hoạt tính gây độc của các cao chiết C. neovolkiana DL0004 đối với các dòng tế bào MCF-7 và Jurkat T. Hoạt tính gây độc của các cao chiết I.

cicadae F0004 đối với các dòng tế bào MCF-7 và Jurkat T. Xác định cao chiết có khả năng gây độc tế bào cao. Nghiên cứu cảm ứng apoptosis tế bào MCF-7 và Jurkat T với các cao chiết tiềm năng. Nghiên cứu cao PE của sinh khối Cordyceps neovolkiana DL0004 cảm ứng apoptosis tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T.

Kết quả đánh giá khả năng cảm ứng apoptosis của cao EA từ quả thể I. Phân chất, tinh sạch và định danh các hợp chất của các cao chiết có tiềm năng kháng phân bào. Phân chất cao PE của sinh khối C. Phân chất cao EA của quả thể Isaria cicadae F0004 [59].

Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T của các chất. Kết quả khả năng cảm ứng apoptosis tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T của ergone. Hình thái tế bào MCF-7 và Jurkat T sau khi nhuộm với AO/EB. Phân tích Chu kỳ tế bào bằng phương pháp flow cytomeretry.

Định lượng tế bào bị cảm ứng apoptosis bằng phương pháp nhuộm Annexin V/PI .96 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .101 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Diễn giải AO Acridine orange cridin cam ATCC the American Type Culture Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ Collection bFGF Basic Fibroblast Growth Factor Nhân tố sinh trưởng nguyên bào sợi Bu n-Butanol CAT Enzyme catalase CPT Camptothecin DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EA Ethyl acetate EB Ethidium bromid EDTA Ethylene diamin etetraacetic acid ED50 Effective dose, 50% Liều lượng hiệu quả EP Ergosterol peroxid EPS Exopolysaccharid Polysaccharid ngoại bào EPSF Exopolysaccharid fragment Phân đoạn polysaccharid ngoại bào vi ER Estrogen Et Ethanol FBS Fetal bovine serum Huyết thanh thai bò GPx Glutathione peroxidase HMBC Heteronuclear multiple bond Phổ HMBC correlation HSQC Heteronuclear single quantum Phổ HSQC coherence IC50 The half maximal inhibitory Nồng độ ức chế tối đa một nửa concentration IFN Interferon-gamma LD50 Lethal dose, 50% Liều lượng gây chết một nửa LPS Lipopolysaccharid MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 Dòng tế bào MCF-7 MDA Malondialdehyde Meth A Meth A fibrosarsoma MIC The minimum inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu concentration MMP2 Matrix metallopeptidase 2 MTH Methuselah Gen Methuselah MTT MTT assay Xét nghiệm phương pháp MTT vii NAD Nicotinamid adenin dinucleotid NCI National Cancer Institute Viện ung thư Quốc gia Hoa kỳ NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng tứ hạt nhân PARP Poly ADP-ribose polymerase PE Petroleum ether Ête dầu hỏa PHA Phytohaemagglutinin PI Propidium iodide Poly Polysaccharide PPCs Polysaccharide-peptides các polysaccharid-peptid QT Fruit body quả thể ROS Reactive oxygen species các gốc tự do có oxy SK Mycelium Sinh khối SOD Superoxide dismutase SRB sulforhodamin B TCA Trichloroacetic acid TLC Thin-layer chromatography Sắc ký bản mỏng TNF Tumor necrosis factor yếu tố hoại tử khối u W Water extract cao nước WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3. Hiệu suất chiết cao trung bình từ sinh khối và quả thể nấm C. 46 neovolkiana DL0004 và I. Giá trị IC50 (µg/mL) của các cao chiết từ sinh khối và quả thể 57 nấm C.

neovolkiana DL0004 và I. cicadae F0004 gây độc tế bào MCF-7 và Jurkat T Bảng 3. Kết quả gây độc tế bào của một số hợp chất cô lập được từ C. 92 neovolkiana DL0004 và I.

cicadae F0004 nhân tạo tại nồng độ 100 µg/mL ix DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1. Một số quả thể nấm Cordyceps tự nhiên 4 Hình 1. cicadae (B) tự nhiên 6 Hình 1. Các loại nucleosid đặc biệt ở Cordyceps 13 Hình 2.

Quy trình chiết cao phân đoạn 29 Hình 3. neovolkiana DL0004, (B) quả thể C. 45 neovolkiana DL0004, (C) sinh khối I. cicadae F0004, (D) quả thể I.

Tỷ lệ ức chế tế bào MCF-7 của cao chiết từ sinh khối và quả thể 50 C. neovolkiana DL0004 tại nồng độ 100 µg/mL Hình 3. Tỷ lệ ức chế tế bào Jurkat T của cao chiết từ sinh khối và quả 51 thể C. neovolkiana DL0004 tại nồng độ 100 µg/mL Hình 3.

Tỷ lệ ức chế tế bào MCF-7 của cao chiết từ sinh khối và quả thể 54 I. cicadae F0004 tại nồng độ 100 µg/mL Hình 3. Tỷ lệ ức chế tế bào Jurkat T của cao chiết từ sinh khối và quả 55 thể I. cicadae F0004 tại nồng độ 100 µg/mL Hình 3.

Hình thái tế bào MCF-7 và Jurkat T nhuộm AO/EB sau khi xử 61 lý với cao chiết PE của sinh khối C. neovolkiana DL0004 Hình 3. Sự thay đổi tỷ lệ tế bào ung thư MCF-7 các pha của chu kỳ tế 63 bào sau xử lý cao PE từ sinh khối C. neovolkiana DL0004 x Hình 3.

Sự thay đổi tỷ lệ tế bào ung thư Jurkat T các pha của chu kỳ tế 65 bào sau xử lý cao PE từ sinh khối C. neovolkiana DL0004 Hình 3. Tỷ lệ tế bào MCF-7 thay đổi sau xử lý với cao chiết PE từ sinh 66 khối của C. neovolkiana DL0004 và nhuộm Annexin V/PI Hình 3.

Tỷ lệ tế bào Jurkat T thay đổi sau xử lý với cao chiết PE từ 68 sinh khối C. neovolkiana DL0004 và nhuộm Annexin V/PI Hình 3. Hình thái tế bào MCF-7 và Jurkat nhuộm AO/EB khi xử lý 70 với cao EA từ quả thể I. Sự thay đổi tỷ lệ tế bào ung thư MCF-7 các pha của chu kỳ tế 72 bào sau xử lý cao EA từ quả thể I.

Sự thay đổi tỷ lệ tế bào ung thư Jurkar T các pha của chu kỳ tế 74 bào sau xử lý cao EA từ quả thể I. Tỷ lệ tế bào ung thư MCF-7 sau xử lý cao EA từ quả thể I. 76 cicadae F0004 và nhuộm Annexin V/PI Hình 3. Tỷ lệ tế bào ung thư Jurkat T sau xử lý cao EA từ quả thể 79 I.

cicadae F0004 và nhuộm Annexin V/PI Hình 3. Hình thái tế bào MCF-7 và Jurkat khi xử lý với ergone 95 Hình 3. Tỷ lệ tế bào MCF-7 tại các pha của Chu kỳ tế bào sau xử lý 96 ergone từ cao PE của sinh khối C. neovolkiana DL0004 xi Hình 3.

Tỷ lệ tế bào Jurkat T tại các pha của Chu kỳ tế bào sau xử lý 98 ergone từ cao PE của sinh khối C. neovolkiana DL0004 Hình 3.