Luận án TS Dược học: Nghiên cứu Rễ Ba Kích Việt Nam - Thành phần, Chế phẩm Sinh học, DNA

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình và có hiệu quả của nhiều cá nhân, tập thể, của các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin cảm ơn PGS. Đoàn Cao Sơn – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và PGS. Bùi Hồng Cường – Phó trưởng Bộ môn Dược học Cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Phòng Đào tạo Sau đại học, GS. Thái Nguyễn Hùng Thu, cùng các thầy, cô của Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ và chia sẻ kinh nghiệm để tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ Công thương đã cấp kinh phí cho Đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học của rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD. Trần Việt Hùng – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp.

Hồ Chí Minh, chủ nhiệm đề tài và các anh, chị, em đồng nghiệp của Khoa Kiểm nghiệm Đông dược dược liệu, Khoa Thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực nghiệm để tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin chân thành cả ơn gia đình tôi và những người bạn, đồng nghiệp đã luôn ủng hộ, động viên khích lệ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 NCS.

Phạm Văn Kiền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT. i DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU. iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ. vii ĐẶT VẤN ĐỀ.

Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis). Vị trí phân loại của Ba kích. Đặc điểm hình thái. Phân bố, thu hái, chế biến.

Thành phần hoá học. Tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích. Monotropein và nystose. Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose.

Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein, nystose trên thế giới và tại Việt Nam. Phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ Ba kích. Phương pháp phân tích trình tự ADN trong định danh loài Morinda officinalis How. Quy trình phân tích mã vạch ADN cho thực vật.

Phương pháp khuếch đại gen (PCR). Các trình tự gen thường dùng cho thực vật. Nghiên cứu về đa dạng di truyền loài Morinda officinalis How. Tính cấp thiết của luận án .23 CHƯƠNG II.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu. Phương tiện nghiên cứu. Chất chuẩn và dược liệu chuẩn.

Hóa chất và thuốc thử. Thiết bị, dụng cụ. Phương pháp nghiên cứu. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose.

Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính, định lượng .48 CHƯƠNG III.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng nystose.

Thẩm định phương pháp định tính nystose trong dược liệu rễ Ba kích bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích60 3. Chiết xuất cao chiết toàn phần chứa monotropein và nystose. Phân lập và tinh chế monotropein.

Phân lập và tinh chế nystose. Xác định bộ dữ liệu nhận dạng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose. Thiết lập chất chuẩn monotropein.

Thiết lập chất chuẩn nystose. Định tính, định lượng monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN. Chiết tách ADN toàn phần từ dược liệu.

Nhân bản đoạn gen. Giải trình tự gen và định danh dược liệu. Phân tích trình tự gen. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính và định lượng.

Bổ sung các chỉ tiêu định tính, định lượng vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam. Dự thảo chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam VI. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose. Phương pháp định tính, định lượng monotropein trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích.

Phương pháp định tính, định lượng nystose trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích. Thẩm định phương pháp định tính nystose trong dược liệu bằng TLC. Chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích. Chiết cao toàn phần.

Phân lập, tinh chế monotropein. Phân lập, tinh chế nystose. Xác minh cấu trúc monotropein và nystose tinh chế được. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose.

Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính, định lượng. Bổ sung chỉ tiêu định tính. Bổ sung chỉ tiêu định lượng.

Những đóng góp mới của luận án .122 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.123 TÀI LIỆU THAM KHẢO. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid ribonucleic : Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình độ dài các AFLP đoạn được nhân bản chọn lọc : Angiosperm Phylogeny Group II - Nhóm phát sinh chủng loài APG II thực vật hạt kín ARS : ASEAN Reference Standards - Chất chuẩn khu vực ASEAN CBOL : Consortium for the Barcode of Life cpDNA : Chloroplast Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lục lạp ptDNA : Plasma tumor Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lạp thể DĐVN : Dược điển Việt Nam DNA : Deoxyribo Nucleic Acid dNTP : Deoxynucleoside triphosphate dATP : Deoxyadenosine triphosphate dCTP : Deoxycytidine triphosphate dGTP : Deoxyguanosine triphosphate EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ELSD : Evaporative light scattering detector - Detector tán xạ bay hơi EPRS : EP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Châu Âu ETS : External transcribed spacer – Vùng sao mã ngoài gene : Diễn đàn hòa hợp về thuốc thảo dược của các nước Tây Thái Bình FHH Dương HPLC-DAD : Sắc ký lỏng hiệu năng cao detector mảng diod HPLC-ELSD : Sắc ký lỏng hiệu năng cao detector tán xạ bay hơi FOS : Fructo Oligo Saccharid ICRS : Chất chuẩn Dược điển Quốc tế i IGS : Intergenic spacer – vùng chen giữa các gene IR : Vùng gen lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR) ISSR : Inter-Simple Sequence Repeats – Chuỗi lặp lại đơn giản giữa ITS : Internal transcribed spacer KNV : Kiểm nghiệm viên LDL : Low density lipoprotein LSC : large single copy – vùng đơn gen lớn matK : Maturase K MeOH : Methanol mRNA : Messenger Ribonucleic acid NCBI : National Center for Biotechnology Information PTN : Phòng thử nghiệm PCR : Polymerase chain reaction – Kỹ thuật khuếch đại gen QTL : Quantiative Trait loci RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA rbcL : Rubisco large subunit gene SKLM : Sắc ký lớp mỏng SSC : Small single copy - Vùng đơn gen nhỏ TBE : Tris/Borate/EDTA TCCL : Tiêu chuẩn chất lượng TLC : Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng TIS : Transcription start site – Điểm khởi đầu sao chép TRIS : Tris(hydroxymethyl)aminomethane USPRS : USP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Mỹ UV-VIS : Ultraviolet-Visible - Tử ngoại – khả kiến WHO : World health organization - Tổ chức Y tế thế giới ii DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1. Vị trí phân loại của chi Morinda. Tóm tắt chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển.

Chương trình gradient dung môi định lượng nystose. Một số đơn vị cung cấp chất chuẩn monotropein và nystose. Danh mục mã hoá các mẫu Ba kích. Nội dung thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein [52].

Nội dung thẩm định phương pháp định lượng nystose [52]. Chương trình gradient pha động sắc ký lỏng điều chế. Nồng độ các thành phần tham gia phản ứng. Các mồi chung cho các trình tự ITS và các gen trên chloroplast.

Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS1-ITS4 [84]. Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS U4-ITS P5 [36]. Chương trình PCR cho đoạn mồi của matK 1326R-390F [39]. Chương trình PCR cho đoạn mồi của rcbLaF-rcbLaR [54], [56].

Chương trình PCR cho đoạn mồi của trnH-pbsA [48]. Nồng độ các thành phần tham gia phản ứng giải trình tự đoạn gen. Độ thích hợp hệ thống sắc ký phương pháp định lượng monotropein. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng monotropein.

Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng monotropein trong nguyên liệu. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng monotropein trong dược liệu BK5. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng monotropein trong nguyên liệu. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng monotropein trong dược liệu BK5.

Độ thích hợp hệ thống phương pháp định lượng nystose. Kết quả khảo sát độ tuyến tính phương pháp định lượng nystose. Kết quả độ chính xác trung gian của phương pháp định lượng nystose trong nguyên liệu. Kết quả độ chính xác của phương pháp định lượng nystose trong dược liệu BK5.

Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng nystose trong nguyên liệu. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng nystose trong dược liệu BK5. Số liệu phổ 1H-NMR (D2O, 500 MHz) của chất phân tích và tham khảo * (D2O, 600 MHz). Số liệu phổ 13C-NMR (D2O, 125 MHz) của chất phân tích và tham khảo * (D2O, 100 MHz).

Kết quả mất khối lượng do làm khô của nguyên liệu monotropein. Kết quả xác định tạp chất trong nguyên liệu monotropein. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn monotropein. Số lượng lọ chuẩn monotropein.

Kết quả đánh giá đồng nhất lô chất chuẩn monotropein. Kết quả đánh giá liên phòng chất chuẩn monotropein. Kết quả hàm lượng chất chuẩn monotropein. Kết quả định lượng độ ổn định chất chuẩn monotropein (6 tháng).

Kết quả định lượng độ ổn định chất chuẩn monotropein (1 năm). Kết quả xác định tạp chất liên quan độ ổn định chất chuẩn monotropein (6 tháng) .