Phân lập và ứng dụng vi khuẩn phân giải keratin trong chăn nuôi - Quách Thị Thanh Tâm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ QUÁCH TH TH NH T M PH N LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN PH N GIẢI KER TIN TRONG CHĂN NUÔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 CHUYÊN ĐỀ NGHIÊN CỨU SINH HÂN CẦN THƠ, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ QUÁCH TH TH NH T M PH N LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN PH N GIẢI KER TIN TRONG CHĂN NUÔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 CHUYÊN ĐỀ NGHIÊN CỨU SINH NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHO HỌC TS B I TH MINH DI U PGS TS NGUYỄN NH T U N DUNG CẦN THƠ - 2017 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨ VI T NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án này đƣợc hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chƣa đƣợc dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác. Cần Thơ, ngày tháng năm 2017 Nghiên cứu sinh thực hiện Quách Th Thanh T mKER TIN TỪ CHẤT NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHO HỌC 1 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHO HỌC 2SÖC - GI CẦ TS B I TH MINH DI UM PGS.TS NGUYỄN NH T U N DUNG i LỜI CÁM ƠN Với tất cả lòng biết ơn s u sắc, tôi xin ch n thành cám ơn TS i Th Minh iệu và PGS. Nguy n Nhựt Xu n ung đã tận tình hƣớng dẫn và giúp tôi hoàn thành luận án này ô là ngƣời truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và thổi lên ngọn lửa đam mê khoa học, khơi dậy trong tôi sự nỗ lực, tự tin, cố gắng không ngừng và không nản lòng trƣớc những khó khăn trong suốt tiến trình thực hiện luận án tiến sĩ Xin cám ơn Cô đã dành nhiều thời gian, công sức và luôn giúp tôi có đƣợc ngh lực và đ nh hƣớng đúng đắn trong học tập và nghiên cứu Tiến trình hơn 3 năm thực hiện các thí nghiệm trong luận án, tôi đã luôn đƣợc sự quan t m, hỗ trợ của an lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển ông nghệ Sinh học-trƣờng Đại học ần Thơ, quý Thầy ô Viện Nghiên cứu và Phát triển ông nghệ Sinh học, quý Thầy ô Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Đại học ần Thơ, đã giúp tôi có thêm nhiều ngh lực để hoàn thành nội dung nghiên cứu Xin cám ơn: án bộ phòng Thí nghiệm chuyên s u, phòng thí nghiệm Sinh học ph n tử Viện Nghiên cứu và Phát triển ông nghệ sinh học-Trƣờng Đại học ần Thơ đã hỗ trợ tôi thực hiện nội dung nghiên cứu ạn Kim Ngọc, các bạn Nghiên cứu sinh, học viên ao học và các em Sinh viên đã đồng hành c ng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu; đã chia s những khó khăn và khuyến khích, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu uối c ng, xin đƣợc gởi lời biết ơn đến Trƣờng ao đ ng ộng Đồng Vĩnh Long đã sắp xếp công việc và tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi hoàn thành kế hoạch học tập toàn khóa trong chƣơng trình đào tạo tiến sĩ h n thành cám ơn ii TÓM LƢỢC L ng gi s gia cầm là phế phẩm đượ t o r với khối lượng lớn từ hăn nu i và giết mổ gi s gia cầm. Với thành phần chính là keratin (90%), lông khó phân hủy và gây ảnh hưởng xấu đến m i trường.

Sử dụng vi huẩn để phân hủy nguồn chất thải này đ ng là hướng đi mới, vừa có thể giải quyết vấn đề ô nhiễm m i trường l i vừa tận dụng sản phẩm để bổ sung vào thứ ăn hăn nu i ho làm ph n n sinh h Luận án bao gồm 4 nội dung với 12 thí nghiệm nhằm phân lập, tuyển ch n, định danh và khảo sát á điều kiện nuôi cấy phù hợp của các hủng vi khuẩn có khả năng ph n hủy hất thải l ng gi s gi ầm hiệu quả cao, từ đ ứng ụng ủ lông gia cầm với chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 thành bột lông sinh h c dùng nuôi gà thả vườn. Tổng cộng có 429 chủng vi khuẩn hiếu khí bản địa phân hủy chất thải l ng được phân lập. Trong đ 115 hủng vi huẩn phân giải er tin được phân lập trên m i trường với bột lông gia cầm đượ ùng như nguồn carbon và nitơ uy nhất từ 42 mẫu (đất, nước và lông gia cầm) thu ở á ơ sở giết mổ gi ầm thuộc thành phố Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp; 225 hủng vi huẩn ng đượ ph n lập từ 126 mẫu (đất, nướ và l ng heo ở á ơ sở giết mổ gi s Đ c biệt 89 chủng vi khuẩn hịu nhiệt hiếu h hả năng ph n hủy l ng gi ầm ng được phân lập từ 23 mẫu đất và 7 mẫu nước thu t i ơ sở giết mổ và tr i hăn nu i gi ầm ở Vĩnh Long và Đồng Tháp Các hủng vi huẩn phân lập đượ đều thể hiện ho t t nh er tin se trên ơ hất azokeratin. Kết quả ph n t h hả năng ph n hủy ột l ng ho thấy 115 hủng vi huẩn ph n hủy ột l ng gi ầm đ làm giảm hối lượng ột l ng gi ầm từ 20,87% đến 84,31% s u một tuần lắ ủ ở 37o ; 225 hủng vi huẩn ph n hủy l ng heo đ làm giảm hối lượng ột l ng heo từ 6,27% đến 63,38% và 89 hủng vi huẩn hịu nhiệt ng làm giảm hối lượng ột l ng gi ầm từ 7,54% đến 66,66% Trong 429 hủng vi huẩn này, 26 hủng vi huẩn hả năng ph n hủy l ng gi s , gi ầm hiệu quả nhất đượ tuyển h n và định nh theo hệ thống ph n lo i ergey ết hợp với giải tr nh t đo n gen 16S rRN y phát sinh loài đượ v từ á tr nh t đo n gen 16S rRN ủ 26 hủng vi huẩn đượ tuyển h n đ thể hiện mối liên hệ i truyền gi h ng Ngoài r , ết quả n ho thấy phần lớn vi huẩn đượ tuyển h n thuộ lớp Bacilli (73,08% , á hủng vi huẩn n l i thuộ lớp et proteo teri (3,85% , lớp l vo teri (7,69% và lớp mm proteo teri (15,38% iii hủng vi huẩn illus meg terium K79 ph n hủy l ng gi ầm tốt nhất và hủng vi huẩn revi illus p r revis Kr110 ph n hủy l ng gi s tốt nhất đượ tuyển h n để tiếp tụ nghiên ứu về m i trường nu i ấy Kết quả nghiên ứu ho thấy hả năng ph n hủy ột l ng gi ầm ủ illus megaterium K79 và hả năng ph n hủy ột l ng heo ủ revi illus p r revis Kr110 ùng đ t hiệu quả o nhất trong m i trường nu i ấy nhiệt độ 35o và p 8,0 với nồng độ ị h vi huẩn đư vào 10% và h ột l ng là nguồn inh ư ng hứ r on và nitơ Thời gi n nu i ủ sợi l ng gi ầm nguyên với illus meg terium K79 trong 10 tuần ho ết quả ph n hủy là 100% và thời gi n nu i ủ sợi l ng heo nguyên với revi illus p r revis Kr110 trong 10 tuần ho hiệu suất ph n hủy là 38,5% Trong th nghiệm nu i gà, hủng vi huẩn illus meg terium K79 đượ ứng ụng để ủ l ng gi ầm trong 10 tuần đ t o đượ ột l ng sinh h đ t mứ n toàn vi sinh và đượ ùng như nguồn th liệu ung ấp đ m trong hẩu phần với mứ 2%, 5%, 8% ùng nu i ư ng gà thả vườn thành ng Với mứ ổ sung 5% ột l ng sinh h vào hẩu phần đ gi p gà sinh trưởng tốt, t lệ nu i sống o (100% với á h tiêu sinh trưởng và á h tiêu th n thịt tốt đ t tương đương với nghiệm thứ đối hứng T m l i, vi huẩn ph n giải er tin ản đị trong nghiên ứu này có tiềm năng ứng ụng th tế nhờ đáp ứng tốt 3 yêu ầu qu n tr ng: gi p xử lý nguồn nhiễm m i trường từ phế phẩm l ng gi s , gi ầm; gi p tái hế iến nguồn phế phẩm này thành thứ ăn ổ sung protein với giá trị inh ư ng và hả năng tiêu h o cho vật nu i; t o m i trường th n thiện Từ khoá: Bacillus megaterium, Brevibacillus parabrevis Kr110, bột lông sinh học, ch tiêu th n th t tốt, gà thả vƣờn, t l ph n hủy lông iv ABSTRACT Feather and cattle hair were the waste generated in large quantity from livestock and slaughterhouses.

Because their main component is keratin (90%), they are difficultly degraded and become a serious environmental pollutants. Using bacteria to decompose these wastes was a new solution to solve the environmental pollution and used the product as animal supplement feed or bio-fertilizer. This dissertation was carried out on 4 contents with 12 experiments to isolate, screen, identify and survey the suitable culture conditions of two selected keratinolytic bacteria isolates that showing the most effective capacity in feather and pig hair degradation and apply one of them for production biological feather meal as feed supplementation for raising backyard chicken. A total of 429 indigenous aerobic keratinolytic bacteria were isolated.

Specifically, 115 keratinolytic bacterial strains were isolated on agar medium with feather powder used as the sole carbon and nitrogen source from 42 samples (soil, waste water and poultry feather) collecting from the poultry slaughterhouse in Can Tho city, Vinh Long and Dong Thap; 225 keratinolytic bacterial strains were also isolated from 126 samples (soil, waste water and pig hair) collecting from the cattle slaughterhouses. Especially 89 thermophilic keratinolytic strains were isolated from 23 samples of soil, 7 waste water samples collecting from the poultry processing plants and farm in Vinh Long and Dong Thap. All isolated bacteria showed keratinase activity on azokeratin. Results of feather degrading capacity analysis showing 115 strains isolated on feather powder media reduced the feather powder from 20,87% to 84,31% after shaking incubation for a week at 37°C; 225 pig hair strains revealed decomposed capacity from 6,27% to 63,38% in pig hair powder decomposition; and 89 thermophilic strains also reduced feather powder in rating from 7.

Among these 429 keratinolytic bacteria strains, 26 isolates having the most effective degrading capacity were chosen and i entifie uil ing on ergey’s m nu l om ining 16S rRN gene sequen ing Phylogenetic tree deducing from the 16S rRNA partial gene sequences of 26 selected strains showed a genetic link between them. In addition, the identification results noticed that most belonged to Bacilli class (73,08%) and the rest strains as members of Betaproteobacteria class (3,85%), Flavobacteria class (7,69%) and Gammaproteobacteria class (15,38%).