Luận án tiến sĩ: Muỗi cát và thực trạng nhiễm Flavivirus, Leishmania tại 6 tỉnh miền Bắc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DICH TỄ TRUNG ƯƠNG TRẦN HẢI SƠN MUỖI CÁT (DIPTERA: PSYCHODIDAE) VÀ THỰC TRẠNG NHIỄM FLAVIVIRUS, LEISHMANIA TẠI 6 TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC Mã số : 62 42 01 07 Hướng dẫn khoa học :TS. Trần Vũ Phong PGS. Nguyễn Lê Khánh Hằng Hà Nội, 2023 i LỜI CAM ĐOAN Sau thời gian học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu, tôi đã hoàn thành chương trình học tập theo quy định cho nghiên cứu sinh và hoàn thành Luận án tiến sĩ với đề tài: “Muỗi cát (diptera: psychodidae) và thực trạng nhiễm Flavivirus, Leishmania tại 6 tỉnh miền Bắc Việt Nam”. Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS.

Trần Vũ Phong và PGS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, với sự đồng ý của GS. Vũ Sinh Nam - chủ nhiệm đề tài “Sinh thái học các loài muỗi cát ở vùng sâu vùng xa miền Bắc Việt Nam và nguy cơ lây truyền Leishmania sang người” được tài trợ bởi quỹ Nafosted, mã số 106-YS. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình của tác giả nào khác.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những cam kết của mình cũng như nội dung luận án. Hà nội, ngày …. năm 2023 Người cam đoan Trần Hải Sơn ii LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn GS. Vũ Sinh Nam - nguyên Phó Cục trưởng Cục Y tế dự phòng, Bộ Y tế, TS.

Trần Vũ Phong - Trưởng khoa Côn trùng và Động vật Y học, PGS.TS Nguyễn Lê Khánh Hằng - Phó Trưởng khoa Vi rút, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương là những người Thầy/Cô đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, xây dựng đề cương, thu thập, phân tích số liệu, viết báo cáo và hoàn thiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Khoa Côn trùng và Động vật Y học, Khoa Virus, Trung tâm Đào tạo và Quản lý Khoa học - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương đã hỗ trợ, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập triển khai nghiên cứu trên thực địa, trong phòng thí nghiệm và hoàn thiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Sở Y tế, Lãnh đạo và cán bộ Trung tâm Kiểm soát bệnh tật thuộc 6 tỉnh: Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Lạng Sơn, Ninh Bình và Quảng Ninh đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình tổ chức triển khai, thu thập số liệu, luôn tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Bộ Khoa học Công nghệ - Quỹ Nafosted đã hỗ trợ tài chính cho nghiên cứu này.

Tôi xin được tri ân những tình cảm vô bờ của bà, bố mẹ, vợ con tôi và các bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ và động viên tôi trong những ngày tháng học tập và nghiên cứu. Hà nội, ngày …. năm 2023 Nghiên cứu sinh Trần Hải Sơn iii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục.

ii Danh mục bảng. vii Danh mục hình. viii Danh mục một số từ viết tắt. Tổng quan tài liệu.

Muỗi cát và một số đặc điểm dịch tễ. Bậc phân loại của muỗi cát. Sinh học, sinh thái và phân bố của muỗi cát. Các loài muỗi cát ở Việt Nam.

Vai trò của muỗi cát trong việc truyền leishmania. Tỷ lệ nhiễm Flavivirus của muỗi cát trong các nghiên cứu. Flavivirus và một số đặc điểm dịch tễ. Đặc điểm chung của virút nhóm flavivirus.

Sự nhân lên của vi rút thuộc nhóm flavivirus. Đặc tính kháng nguyên (tham khảo thêm). Phương pháp chẩn đoán flavivirus trong phòng thí nghiệm. Bệnh do flavivirus lây truyền qua véc tơ đang lưu hành ở Việt Nam.

Leishmania và một số đặc điểm dịch tễ. Bậc phân loại của leishmania. Ký sinh trùng leishmania và chu kỳ sống. Đặc điểm bộ gen của leishmania.

Phương pháp chẩn đoán leishmania trong phòng thí nghiệm. Leishmaniasis và một số đặc điểm dịch tễ. Đặc điểm lâm sàng, điều trị và phòng ngừa. Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu mục tiêu 1. Địa điểm nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Thời gian thu mẫu.

Thiết kế nghiên cứu. Phương pháp thu thập muỗi cát tại các sinh cảnh khác nhau. Phương pháp làm tiêu bản. Phương pháp định loại muỗi.

Các chỉ số đầu ra trong nghiên cứu. Nhập liệu và phân tích. Phương pháp nghiên cứu mục tiêu 2. Địa điểm nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu. Thiết kế nghiên cứu. Sinh phẩm và trang thiết bị. Xác định/định danh flavivirus bằng kỹ thuật RT-PCR.

Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger. Nhập liệu và phân tích. Phương pháp nghiên cứu mục tiêu 3. Địa điểm nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu. Thiết kế nghiên cứu. Sinh phẩm và trang thiết bị. Phản ứng Nested PCR.

Phương pháp giải trình tự gen NGS (Next generation sequencing). Phân tích bữa ăn máu. Nhập liệu và phân tích. Kết quả nghiên cứu.

Thành phần loài và một số đặc điểm phân bố của muỗi cát tại 6 tỉnh miền bắc việt nam, 2016-2018. Thành phần loài muỗi cát theo giống, mật độ và độ phong phú. Phân bố muỗi cát theo tỉnh. Phân bố muỗi cát theo sinh cảnh đặt bẫy.

Phân bố muỗi cát cái tại 6 tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, 2016. Thực trạng nhiễm flavivirus ở muỗi cát tại địa điểm nghiên cứu .1 Sàng lọc flavivirus trên muỗi cát cái. Xác định flavivirus bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger. Một số đặc điểm flavivirus trên các loài muỗi cát cái.

Thực trạng nhiễm Leishmania ở muỗi cát tại địa điểm nghiên cứu. Sàng lọc Leishmania bằng phương pháp Nested-PCR. Xác định Aeishmania bằng phương pháp giải trình tự gen NGS. Một số đặc điểm của leishmania trên quần thể muỗi cát.

Thành phần loài và một số đặc điểm sinh học sinh của muỗi cát tại 6 tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, 2016-2018. Định loài muỗi cát ở Việt Nam bằng các đặc điểm hình thái. Sinh học sinh thái và sinh cảnh của muỗi cát ở các tỉnh điều tra. Thực trạng nhiễm Flavivirus ở muỗi cát tại địa điểm nghiên cứu.

Xác định flavivirus trên muỗi cát. Tỷ lệ nhiễm Flavivirus trên muỗi cát. Một số đặc điểm của Flavivirus trên các loài muỗi cát cái. Thực trạng nhiễm Leishmania ở muỗi cát tại địa điểm nghiên cứu và nguy cơ lây truyền sang người.

Leishmania xác định được tại Quảng Ninh. Leishmania xác định được tại Sơn La. Leishmania xác định được tại Ninh Bình .114 vi Khuyến nghị .116 Danh mục các bài báo đã công bố .117 Tài liệu tham khảo .1 Phụ lục 01: Phiếu thu thập thông tin sinh cảnh đặt bẫy muỗi cát .1 Phụ lục 02: Hình ảnh chụp tiêu bản muỗi cát .117 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán vi rút nhóm flavivirus.

Bảng tổng hợp các phương pháp xác định và chẩn đoán leishmania. Số lượng, giới tính, mật độ và độ phong phú của muỗi cát theo loài tại 6 tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, 2016. Số lượng muỗi cát, độ phong phú, mật độ và số lượng loài theo tỉnh. Số lượng muỗi cát, độ phong phú, mật độ và số lượng loài theo sinh cảnh 76 Bảng 3.

Thông tin mẫu nghi nhiễm flavivirus trên quần thể muỗi cát. Mẫu nghi nhiễm leishmania bằng phương pháp Nested-PCR (n=20). Kết quả blast các trình tự thu được bằng phương pháp NGS lên cơ sở dữ liệu NCBI. Kết quả phân tích các mẫu có trình tự có sự tương đồng với leishmania bằng phương pháp NGS.

So sánh các trình tự trong mẫu leishmania ở Ninh Bình - Vietnam/NB28062006. So sánh các trình tự trong mẫu leishmania ở Sơn La - Vietnam/ SL210102016. Thông tin mẫu leishmania trên quần thể muỗi cát (n=3). 93 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.

Bậc phân loại từ bộ tới phân giống của muỗi cát. Hình thái các pha trong vòng đời của muỗi cát. Các địa điểm xuất hiện muỗi cát tại miền bắc Việt Nam năm 1935. Sự phát triển của leishmania trong đường tiêu hóa của muỗi cát.

Cây chủng loại phát sinh của nhóm flavivirus. West Nile Virus Koutango lineage (PM148 sandfly MN057643.1) phân lập từ muỗi cát tại Niger, 2016. Chủng flavivirus (MN090154 - Dreznica) phân lập từ muỗi cát tại Bosnia và Herzegovina, 2020. Phân nhóm họ Flaviviridae trong cây phát sinh loài.

Mô hình cấu trúc gen của vi rút thuộc nhóm flavivirus. Cấu trúc sợi đơn ARN của flavivirus. Phân bố của các típ huyết thanh Dengue lưu hành ở Việt Nam. Leishmania trong đại thực bào, b: Leishmanias infantum trong đại thực bào bị phá huỷ, nhuộm Giemsa vết bôi tuỷ xương.

Bản đồ phân bố của 21 loài leishmania gây bệnh cho người. Dạng promastigotes và amastigotes nhuộm Giemsa vật kính 100. Vòng đời của Leishmania infantum. Bản đồ di truyền gen rDNA (nằm trong nhiễm sắc thể số 27) với độ dài đoạn tương ứng ở các loài leishmania.

kDNA maxicircle, các gen thành phần và độ dài đoạn ở 5 loài leishmania: L. kDNA minicircle của các loài leishmania và các mảnh thành phần của nó. CSB: Khối trình tự bảo tồn. Leishmaniasis được tổng hợp tại Trung Quốc 2004-2010.

Leishmaniasis được tổng hợp tại Thái Lan 2004-2010. Leishmaniasis được báo cáo tại Việt Nam. Quy trình giải trình tự gen NGS với mẫu dương tính với nhóm leishmania61 Hình 2. Đo nồng độ DNA bằng Qubit.

Các điểm thu thập và thành phần loài muỗi cát ở 6 tỉnh miền Bắc Việt Nam, 2016. Sự phân bố muỗi cát cái tại 6 tỉnh nghiên cứu, 2016. Kết quả RT-PCR sàng lọc flavivirus trên muỗi cát cái. Tỷ lệ sàng lọc flavivirus trên muỗi cát cái.

Kết quả định loài flavivirus trên web https://www. Kết quả Nested-PCR sàng lọc leishmania trên muỗi cát cái. Cây chủng loại phát sinh trên gen kDNA minicircle của mẫu thu thập tại Ninh Bình (Vietnam/NB28062006). Cây chủng loại phát sinh trên gen kDNA minicircle của mẫu thu thập tại Sơn La (Vietnam/SL210102016).

Cây chủng loại phát sinh gen trên NST 27 của mẫu thu thập tại Quảng Ninh (Vietnam/QN01062016). So sánh trình tự mẫu thu thập tại Quảng Ninh (Vietnam/QN01062016) với chủng L. So sánh trình tự mẫu thu thập tại Quảng Ninh (Vietnam/QN01062016) với chủng L. Khoá định loại vắn tắt bằng hình ảnh muỗi cát cái tại Việt Nam .