Luận án nghiên cứu phân tích thành phần cấu trúc hóa học của fucoidancó hoạt tín

vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC    PHẠM ĐỨC THỊNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN, CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU Ở VỊNH NHA TRANG Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 62.18 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hướng dẫn khoa học: 1. Lê Lan Anh Hà Nội, 2015 www.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu nêu trong luận án là trung thực. Những kết luận khoa học của luận án là chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, 2015 Tác giả Phạm Đức Thịnh www.vn LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng bạn bè và đồng nghiệp. Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Bùi Minh Lý và PGS.TS Lê Lan Anh đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành bản luận án này. Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ Nafosted (Đề tài nghiên cứu khoa học cơ bản, mã số: 104.09) và Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam (Đề tài hợp tác quốc tế, mã số: VAST. 06/13-14) đã hỗ trợ kinh phí cho việc thực hiện Luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của các cô chú, các anh chị em của phòng: - Phòng Hóa phân tích và Triển khai công nghệ nói riêng cũng như Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang nói chung. - Phòng Hóa phân tích, Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa học. Phòng thử nghiệm hoạt tính sinh học - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. - Phòng Hóa enzym, Phòng cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ- Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, Phòng Quản lý Đào tạo sau Đai học - Viện Hóa học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành các học phần của luận án và mọi thủ tục cần thiết. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2015 Tác giả Luận án Phạm Đức Thịnh www.vn i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC.i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.iv DANH MỤC CÁC BẢNG.vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ.viii DANH MỤC PHỤ LỤC.ix MỞ ĐẦU .1 Giới thiệu chung về rong biển .2 Phân loại và phân bố của rong biển .3 Thành phần hóa học có trong rong biển .1 Giới thiệu chung về fucoidan. Thành phần của fucoidan trong rong nâu.

Đa dạng cấu trúc của fucoidan. Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan .3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN.1 Phương pháp phân tích thành phần đường .2 Phương pháp phân tích liên kết.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR).4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).5 Phương pháp phổ khối lượng (MS). TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN.

Tình hình nghiên cứu fucoidan trên thế giới. Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.36 VÀ THỰC NGHIỆM .1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan .2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường .3 Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate .4 Phương pháp khử sulfate .5 Phương pháp phân tích hàm lượng uronic axít .6 Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa .7 Phương pháp thủy phân tạo oligosacarit.8 Phương pháp phổ hồng ngoại IR .9 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR .10 Phương pháp phổ khối lượng MS .11 Phương pháp thử hoạt tính sinh học và xử lý số liệu. Chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu.

Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường. Phân tích hàm lượng sulfate. Phân tích hàm lượng uronic axít. Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa.

Thủy phân tạo fucoidan oligosacarit. Phổ khối MALDI-TOF/MS và ESI-MS của fucoidan oligosacarit. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN.

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của fucoidan. Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn fucoidan được phân lập từ rong Sargassum swartzii và Sargassum mcclurei. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN. Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ IR.

Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ NMR. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN SmF3 ĐƯỢC CHIẾT TÁCH TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI. ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN .97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .vn 1 MỞ ĐẦU Trong đa dạng và vô tận của thảm thực vật đại dương, rong nâu là một trong số các loài thực vật biển có thể tự tái tạo đáng lưu ý nhất mà con người đã phát hiện ra. Rong nâu chứa rất nhiều polysacarit sinh học quí như alginate, laminaran, fucoidan với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [29,103].

Trong số đó fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do có nhiều hoạt tính sinh học quý như: hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối, chống virus, chống ung thư và điều biến miễn dịch, chống viêm, giảm lipid máu, chống oxy hóa và các đặc tính chống bổ thể (anticomplementary), chống lại các bệnh về gan, về đường tiết niệu (uropathy renalpathy), tác dụng bảo vệ dạ dày và khả năng điều trị trong phẫu thuật [69,88]. Fucoidan là một sulfate polysacarit có cấu trúc hóa học rất phức tạp bởi tính đa dạng của liên kết glycoside và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate được sắp xếp không theo quy luật trên mạch polymer. Thành phần của nó bao gồm nhiều loại đường, chủ yếu là fucose và một số các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose., đôi khi còn có axít uronic [23,36,69,71]. Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết của fucoidan, nhưng các kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của chúng về trật tự liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh và vị trí các gốc sulfate vẫn còn rất hạn chế [23,34,35,36,48].

Mặt khác, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ [88,36,38,48,69]. Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để làm dược liệu thì việc xác định chính xác thành phần và cấu trúc hóa học của fucoidan là điều tiên quyết và đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới.200 km bờ biển trải dài từ Bắc xuống Nam, với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000 km2 được thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong nâu rất đa dạng và phong phú, hiện tại đã có khoảng 147 loài rong nâu được phân loại [1,8], trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất www.vn 2 với hơn 60 loài và sản lượng ước tính đạt tới 10.000 tấn rong khô/năm [58]. Tuy nhiên cho đến nay ở nước ta vẫn chưa có một công trình nghiên cứu có tính hệ thống về thành phần hóa học, cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan rong nâu Việt Nam. Do vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang” nhằm hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về fucoidan của rong nâu Việt Nam theo định hướng tìm kiếm những nguồn dược liệu mới phục vụ sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế xã hội.

Mục tiêu của luận án: Chiết tách và phân đoạn fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam. Phân tích thành phần, xác định đặc điểm cấu trúc và mối quan hệ giữa cấu trúc với hoạt tính sinh học của fucoidan. Để đạt được mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm: - Thu thập các loài rong nâu có trữ lượng lớn ở vùng biển vịnh Nha Trang. - Tách chiết và phân đoạn fucoidan từ các loài rong thu được.

- Phân tích thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của fucoidan và các phân đoạn của chúng. - Xác định cấu trúc của fucoidan có hoạt tính quan tâm. - Đánh giá mối tương quan giữa hoạt tính sinh học với đặc trưng cấu trúc của fucoidan www.vn 3 CHƯƠNG 1.1 Giới thiệu chung về rong biển Hàng năm đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong biển. Nhiều nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon trên trái đất được tổng hợp nhờ quang hợp, trong đó 20% có nguồn ngốc từ rong biển [83,97] Việc tiêu thụ sản phẩm từ rong biển (tảo đa bào ở biển) đã trải qua thời kì lịch sử rất lâu dài.

Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, người Nhật đã dùng rong biển từ hơn 10. Trong nền văn hoá Trung Quốc cổ đại, rong biển được coi là đặc sản dùng trong các món ăn của triều đình và chỉ hoàng tộc hay khách của hoàng thân, quốc thích mới được thưởng thức. Dù rong biển được coi là món ăn đặc trưng của châu Á, nhưng trên thực tế các quốc gia có bờ biển trên thế giới như Scotland, Ireland, Newzealand, quần đảo nam Thái Bình Dương và các nước Nam Mỹ ven biển cũng đã sử dụng rong biển từ rất lâu. Rong biển cũng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác.

Chúng là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho công nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong biển, chất tạo gel E400, E401 Alginate–Agar E406, E407, Carrageenan.), mỹ phẩm (chất tạo kết cấu và hoạt hóa), công nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo độ sánh, gel hoặc chất ổn định), thức ăn gia súc, nông nghiệp. Qua các tài liệu tham khảo trong lịch sử và trong thời gian sử dụng lâu dài, không có nguy cơ gây hại sức khỏe nào được đề cập đến rong biển.