Luận án tiến sĩ phân lập và tuyển chọn vi khuẩn kết tụ sinh học chuyển hóa n và

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÊ THỊ LOAN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC, CHUYỂN HÓA N VÀ TÍCH LŨY POLY-P TRONG NƯỚC THẢI SẢN XUẤT HỦ TIẾU MỸ THO VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 Người hướng dẫn khoa học GS. TS Cao Ngọc Điệp Cần Thơ - 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÊ THỊ LOAN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC, CHUYỂN HÓA N VÀ TÍCH LŨY POLY-P TRONG NƯỚC THẢI SẢN XUẤT HỦ TIẾU MỸ THO VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI LUẬN ÁN TIẾN SĨ VI SINH VẬT HỌC Cần Thơ – 2020 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cám ơn: - Quý thầy cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã cung cấp kiến thức và hướng dẫn cho tôi trong suốt quá trình học tập. Cao Ngọc Điệp đã tận tình hướng dẫn, góp ý cũng như là tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài. - Tiến sĩ Trần Thị Giang, giảng viên cùng nghiên cứu sinh Trần Vũ Phương và cán bộ phụ trách phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường, phòng thí nghiệm vi sinh vật đất của Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, sinh viên Nguyễn Võ Tấn Lực, MSSV: B150445, Lớp: CNSH A2K41; Đặng Ngọc Bảo, MSSV: B1504422, Lớp: CNSH A2K41 Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

- Gia đình chú Trương Văn Thuận tại ấp Hội Gia, xã Mỹ Phong, thành phố Mỹ Tho đã cũng cấp nguồn nước thải, địa điểm thực hiện đề tài, tạo điều kiện giúp đở để đề tài được hoàn thiện tốt nhất. - Thạc sĩ Trịnh Thị Thắng phụ trách phòng thí nghiệm, Tiến sĩ Lê Quang Khôi, Phó Giám đốc Sở Khoa học và Công nghệ sinh tỉnh Tiền Giang đã hỗ trợ, cung cấp kết quả cho đề tài. - Quý Thầy cô, anh, chị công tác tại Trung tâm học liệu đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình tìm kiếm tài liệu đề hoàn thành đề tài. Trân trọng! Cần Thơ, ngày tháng năm 2020 Lê Thị Loan i TÓM LƯỢC Phân lập, tuyển chọn, và nhận diện vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa N và tích lũy poly-P và trong nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho và ứng dụng xử lý nước thải Hủ tiếu là sản phẩm được sản xuất từ hạt gạo nấu chín ở châu Á; Quá trình chế biến hủ tiếu đã thải ra một lượng nước thải chứa nhiều độc tố gây ảnh hưởng đến môi trường sống và sức khỏe con người.

Mục tiêu đề tài là phân lập, tuyển chọn và ứng dụng các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và dòng vi khuẩn tích lũy poly-Phosphate tốt để xử lý nước thải. Tổng số 42 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, 59 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và 8 dòng vi khuẩn tích lũy poly-Phosphate được phân lập từ nước thải của 8 cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang, Việt Nam. Vi khuẩn kết tụ sinh học chia làm 2 nhóm: kết tụ protein và polysaccharide; vi khuẩn chuyển hóa nitơ dị dưỡng chia làm 4 nhóm: vi khuẩn oxi-hóa ammonium (15 dòng), vi khuẩn oxi-hoa nitrite (15 dòng), vi khuẩn oxi-hoá nitrate (18 dòng) và vi khuẩn nitrate và phản-nitrate hóa (11 dòng). Phân tích gene 16S rDNA và giải trình tự cho thấy tất cả chúng có mức độ đồng hình từ 97% đến 99%, tất cả các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học và tích lũy poly-P đều thuộc họ Bacilaceae trong khi đó chi Bacillus chỉ chiếm 12% ở vi khuẩn chuyển hóa nitơ còn lại thuộc vi khuẩn Gram âm (Proteobacteria).

Tuyển chọn được 2 dòng kết tụ sinh học Bacillus subtilis PRO.C và Bacillus subtilis PO.B, dòng chuyển hóa nitơ Stenotrophomonas maltophilia HNa.03C và dòng vi khuẩn tích lũy poly- Phosphat Bacillus megaterium poly-P.4B để xử lý nước thải hủ tiếu từ 100-mL, 1-L, 10-L, 100-L và 1000-L và kết quả đạt được pH nước thải từ 4,68 lên 6,13, TSS từ 369 mg/L giảm xuống 17 mg/L, BOD 5 từ 1200 mg/L giảm xuống 23 mg/L, TN từ 45 giảm xuống 7,57 mg/l, TP từ 7,57 giảm xuống 4,76 mg/đạt tiêu chuẩn B, của QCVN40:2011/BTNMT sau 4 ngày sục khí 8/24 giờ. Từ khóa: Vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, Vi khuẩn chuyển hóa đạm ,Vi khuẩn tích lũy lân hòa tan, nước thải hủ tiếu. ii ABSTRACT Isolation, Selection and Identification of bioflocculant-producing bacteria, heterotrophic nitrogen removal bacteria and poly-P nurturing bacteria in wastewater from “hu tieu My Tho” mills, Tien Giang province, Vietnam and their application for wastewater treatment Hu tieus are a form of rice product from cooked rice grain in Asia. The process of hu tieu production discharges an amount of wastewater containing a multitude of toxins that cause environmental degradation and human health risks.

The aim of the study was to isolate, screen and utilize bioflocculant-producing bacteria, heterotrophic nitrogen-removal bacteria, poly-phosphate nurturing bacteria as way of wastewater treatment. A total of 42 bioflocculant-producing bacterial strains (BPB), 59 heterotrophic nitrogen removal bacterial (HNRB) strains and 8 poly-Phosphate nurturing bacterial strains were isolated from wastewater of 8 hu tieu mills of My Tho City, Tien Giang province, Mekong Delta, Vietnam. Bioflocculant-producing bacterial strains were divided into two groups: protein- flocculant and polysaccharide; HNRB strains were classified into four groups of heterotrophic ammonium-oxidizing bacteria (15 strains), nitrite-oxidizing bacteria (15 strains), nitrate-oxidizing bacteria (18 strains) and heterotrophic nitrifying and denitrifying bacteria (11 strains). The virtually complete 16S rRNA gene was PCR amplified and sequenced.

The sequences from the selected BPB, HNR and poly-P bacterial strains all showed high degrees of similarity to those of the GenBank references strains (between 97% and 99%). Phylogenetic trees based on the 16S rDNA sequences displayed high consistency, with nodes supported by high bootstrap (1000) values. These presumptive HNRB strains were categorized into two groups that included members of genera belonged to Gram-positive bacteria phylum and Proteobacteria phylum while BPB and poly-P bacteria strains belonged to bacilli. Application of two strains BPB Bacillus subtilis PRO.C and Bacillus subtilis PO.B, HNR Stenotrophomonas maltophilia HNa.03C and poly-P iii Bacillus megaterium P.B to treat wastewater from hu tieu in containers from 100mL, 1L, 10L, 100L and 1000L, the results recorded that pH of wastewater increased from 4.13, TSS and BOD 5 concentration of wastewater reduced from 369 and 1200 mg/L to 17 and 23 mg/L, respectively.

Total nitrogen and total phosphorous decreased from 45 and 6. All targets reached B level according to QCVN40/2011 standard/Ministry of Natural Resource and Environment of Vietnam. Keywords - Bioflocculant-producing bacteria, Heterotrophic Nitrogen Removal Bacteria, Poly-Phosphate bacteria, Rice-noodle, wastewater v MỤC LỤC Chương 1 – Giới thiệu .2 Mục tiêu của nghiên cứu .3 Đối tượng nghiên cứu.4 Thời gian và địa điểm thu mẫu .5 Nội dung nghiên cứu .6 Đóng góp mới và ý nghĩa của luận án. 2 Chương 2 – Tổng quan tài liệu .1 Hiện trạng sản xuất hủ tiếu ở thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang .2 Quy trình sản xuất bánh hủ tiếu tại các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho .3 Vấn đề về nước thải và chất lượng nước thải của các cơ sở sản xuất hủ tiếu .4 Quy trình và biện pháp xử lý nước thải tại các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho .5 Vi khuẩn kết tụ sinh học.1 Kết tụ sinh học (Bioflocculant) .2 Kiểm tra khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của vi khuẩn bằng dung dịch kaolin .3 Cơ chế và đặc điểm của quá trình kết tụ sinh học (Mechanisms of Bioflocculation) .4 Một số nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học .5 Ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nuớc thải .5 Vi khuẩn chuyển hóa Nitơ (đạm) trong nước thải .1 Độc tính của Amoni và các hợp chất Nitơ dạng oxy hóa .2 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa Nitơ ngoài nước và trong nước .7 Vi khuẩn tích lũy lân dạng poly (poly-P) .1 Các dạng phospho tồn tại trong tự nhiên .2 Loại bỏ phospho bằng hóa chất.3 Loại bỏ phospho bằng con đường sinh học.4 Vi khuẩn tích lũy lân dạng poly (poly-P).5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn tích lũy poly-P ngoài nước và trong nước.1 Những nghiên cứu vi khuẩn tích lũy poly-P ngoài nước.2 Những nghiên cứu vi khuẩn tích lũy poly-P ở Việt Nam.8 Các nghiên cứu và ứng dụng 3 nhóm vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa đạmNitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P trong và ngoài nước.2 Các phương pháp xử lý nước thải trong ngành chế biến thực phẩm.1 Nước thải ngành chế biến thực phẩm.2 Tổng quan các phương pháp xử lý nước thải ngành chế biến thực phẩm.3 Xử lý nước thải chế biến thực phẩm bằng phương pháp sinh học hiếu khí.9 Các phương pháp xử lý nước thải tiên tiến trong và ngoài nước.1 Các biện pháp loại bỏ Nitơ.1 Loại bỏ nitơ bằng biện pháp sinh học: nitrate hóa và phản nitrate hóa .2 Loại bỏ nitơ bằng phương pháp hóa lý.2 Các biện pháp tích lũy Phospho.1 Loại bỏ lân bằng biện pháp sinh học.2 Loại bỏ lân bằng phương pháp hóa lý.3 Ứng dụng màng lọc tiên tiến xử lý nước thải.

52 Chương 3 – Phương tiện và phương pháp nghiên cứu.1 Vật liệu thí nghiệm.1 Môi trường nuôi cấy.1 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein.2 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học vii polysaccharide.3 Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ.4 Môi trường phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P.2 Nguyên liệu và vật liệu thí nghiệm.2 Phương pháp nghiên cứu.2 Đếm mật số vi khuẩn.3 Phân lập vi khuẩn.1 Phân lập vi khuẩn.2 Trữ mẫu và mô tả đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn.4 Tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa Nitơ N và vi khuẩn poly-P.5 Ứng dụng các dòng vi khuẩn tốt trên nước thải hủ tiếu.1 Ứng dụng các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học vào xử lý nước thải hủ tiếu Mỹ Tho.2 Ứng dụng các dòng Vi khuẩn chuyển hóa Nitơ và dòng vi khuẩn Poly-P vào xử lý nước thải hủ tiếu Mỹ Tho.3 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 1- L 78 3.4 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 10-L 79 3.5 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 100-L. 79 Chương 4 - Kết quả và thảo luận.1 Mật số vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P.2 Phân lập các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa N và viii vi khuẩn tích lũy poly-P .1 Phân lập các dòng vi khuẩn kết tụ sinh sinh học .1 i khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học trên môi trường protein .