Luận án: Thu nhận và xác định tính chất exopolysaccharide từ Lactobacillus plantarum

MỞ ĐẦU Vi khuẩn lactic (LAB: Lactic Acid Bacteria) là nhóm vi khuẩn có lợi được sử dụng phổ biến trên thế giới. Bên cạnh được sử dụng làm giống khởi động trong các sản phẩm lên men lactic, chúng còn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin, exopolysaccharide (EPS)… hay được dùng để sản xuất các chế phẩm probiotic. Những polysaccharide (PS) được sử dụng trong thực phẩm và y dược thường có các tính chất cơ lý tốt cho các ứng dụng như: kéo sợi, màng, keo, chất làm đặc, tạo gel tác nhân truyền dẫn thuốc… Nguồn cung cho các PS này hiện nay chủ yếu từ thực vật như tinh bột, agar, galactomannan, pectin, carageenan và aginate. Nhờ vào cấu trúc mạch dài, các PS này có thể đáp ứng được những yêu cầu trên.

Tuy nhiên, để hoàn thiện các tính chất lưu biến này, hầu như các hợp chất PS có nguồn gốc thực vật khi đưa vào sử dụng đều phải được xử lý bằng phương pháp enzyme và phương pháp hóa học. Vì vậy, khả năng ứng dụng của chúng vẫn có một số hạn chế nhất định. Trong lúc đó, việc khai thác các hợp chất PS từ vi sinh vật có nhiều tính ưu việt hơn so với từ thực vật như chu kỳ sinh trưởng và phát triển ngắn, môi trường nuôi cấy rẻ tiền, dễ điều khiển quá trình sản xuất. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều loại các PS như PS nội bào, PS tạo cấu trúc cho thành tế bào (lipopolysacchride, peptidoglycan.

Hơn nữa, nếu được tổng hợp từ những loại vi sinh vật không gây hại, PS là vật liệu an toàn và có khả năng phân hủy sinh học tốt. Thậm chí có thể sử dụng trực tiếp vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp PS ngoại bào vào trong một số sản phẩm. Ngoài việc đóng vai trò cho hoạt động sống của tế bào, EPS cũng như các hợp chất PS khác có các tính chất chức năng công nghệ được sử dụng như các chất phụ gia thực phẩm. Ở các nước châu Âu và Mỹ, các hợp chất này thường được sử dụng để cải thiện chất lượng của các sản phẩm chế biến từ sữa.

Chúng không chỉ có vai trò rất quan trọng trong việc tăng khả năng hấp dẫn bởi hình thức bên ngoài của thực phẩm mà còn góp phần ổn định sản phẩm và hoàn thiện tính lưu biến. Các nhà công nghệ đã dựa trên cơ sở đó mà phát triển sản phẩm mới. 1 Bên cạnh đó, EPS của vi khuẩn lactic còn có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe người và động vật như hoạt tính tăng cường khả năng miễn dịch, kháng virus, chống oxy hóa, chống ung thư và chống cao huyết áp. Vì vậy, nghiên cứu về khả năng thu nhận EPS của vi khuẩn lactic cùng với cấu trúc, tính chất cũng như khả năng ứng dụng của chúng đang là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học quan tâm.

Từ những lý do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu điều kiện thu nhận, xác định tính chất và thành phần monosaccharide của exopolysaccharide từ một số chủng thuộc loài Lactobacillus plantarum”. Đề tài được thực hiện với các nội dung: 1. Xác định điều kiện nuôi cấy và thu nhận EPS từ dịch lên men của các chủng L. plantarum nghiên cứu.

Khảo sát một số tính chất có lợi của các EPS được sinh tổng hợp bởi các chủng L. plantarum nghiên cứu. Cung cấp thông tin về cấu trúc của EPS thu nhận được. Bước đầu khảo sát khả năng ứng dụng các chủng L.

plantarum nghiên cứu trong lên men sữa đậu nành. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về vi khuẩn lactic 1. Giới thiệu về vi khuẩn lactic LAB là những vi khuẩn Gram dương, catalase âm tính, sống trong điều kiện hiếu khí hoặc kị khí nghiêm ngặt, không có khả năng tạo bào tử.

Lactic acid được xem như là sản phẩm cuối cùng trong quá trình lên men carbohydrate của LAB. Các LAB bao gồm cả dạng cầu khuẩn (như Lactococcus, Vagococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Tetragenococcus, Streptococcus, Enterococcus) và trực khuẩn (như Lactobacillus, Carnobacterium). LAB (đặc biệt là các chi Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus) từ lâu đã được sử dụng như các chủng vi khuẩn khởi đầu cho quá trình lên men của nhiều loại thực phẩm và đồ uống nhờ vai trò của chúng trong việc tạo hương vị, phát triển mùi thơm và làm chậm sự hư hỏng. Đây cũng chính là một trong những kỹ thuật lâu đời nhất được dùng như một phương pháp bảo quản thực phẩm [25].

Ngày nay, LAB được sử dụng phổ biến trong các sản phẩm từ sữa (như pho mát, sữa chua, kefir và bơ sữa), trong sản xuất bánh mì, các sản phẩm thịt, bảo quản rau quả. Bên cạnh đó, LAB cũng có nhiều tác động có lợi đến sức khỏe người sử dụng. Việc khai thác và sử dụng các chủng LAB khác nhau phụ thuộc vào tính năng probiotic, khả năng sống sót của vi khuẩn trong thực phẩm cũng như trong đường ruột đối tượng sử dụng nhằm cung cấp chế độ ăn phù hợp để cải thiện sức khỏe con người và vật nuôi… [45]. Lactobacillus thuộc nhóm các LAB, còn được gọi là trực khuẩn Döderlein, là một chi của Gram dương kỵ khí tùy tiện hoặc hiếu khí.

Chúng là các trực khuẩn phổ biến nhất với 64 loài [25]. Lactobacillus thuộc nhóm lên men dị hình chính của ruột người, có khả năng sống sót tốt trong hệ tiêu hóa của con người do đó chúng cũng được sử dụng để tạo ra các chế phẩm có tiềm năng probiotic. plantarum là một loài vi khuẩn không gây bệnh, Gram dương, không có khả năng di động, không sinh bào tử, khuẩn lạc tròn và trơn, màu trắng sữa, chúng lên 3 men kỵ khí tùy tiện và thường được sử dụng trong bảo quản các loại thực phẩm lên men. plantarum thuộc nhóm vi khuẩn có bộ gen lớn nhất trong số các LAB.

plantarum thường được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm, đồng thời nó cũng thường xuất hiện trong đường tiêu hóa và nước bọt của người [7]. Tính chất đặc trưng duy nhất của L. plantarum là khả năng dị hóa arginine và sinh ra NO. plantarum không có khả năng phân giải amino acid nào ngoại trừ tyrosine và arginine.

Có đến 6 con đường chuyển hóa arginine khác nhau và đều sinh ra NO. Việc sinh ra NO giúp ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida albicans, E. coli, Shigella, Helicobacter pylori các amip và kí sinh trùng [76]. plantarum còn có vai trò vô cùng quan trọng, nó không những chống lại các bệnh nhiễm trùng đường ruột mà còn ngăn chặn sự bám dính của E.

coli vào màng nhầy, làm giảm độc tố do E. coli tiết ra cũng như làm giảm đáng kể vi sinh vật kị khí Gram âm như Enterobacteriaceae. Nghiên cứu gần đây cho thấy L. plantarum còn có khả năng làm giảm cholesterol bằng cách phân hủy acid mật.

plantarum được xem như một loại vaccin sống có khả năng ứng dụng trong phạm vi rộng. Như vậy, hệ vi khuẩn lactic nói chung và các chủng L. plantarum nói riêng có nhiều tính chất có lợi được ứng dụng rộng rãi trong y dược, công nghệ thực phẩm. Khái niệm về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic Rất nhiều vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp PS.

Các PS của chúng tạo thành một nhóm lớn polymer sinh học có nhiều vai trò khác nhau. Chúng có thể là một phần của thành tế bào (như β-glucan của nấm), là chu chất (periplasmic) bảo vệ tế bào, là một chất dạng nhờn ở trên các bề mặt giúp gắn tế bào này với tế bào khác (chẳng hạn như xanthan và gellan) hay là một phần năng lượng dự trữ cho tế bào (như polyhydroxybutyrate)… [39]. Người ta có thể phân loại PS của vi khuẩn dựa vào vị trí của nó trên tế bào [78]. Những PS được tiết ra bên ngoài màng tế bào được gọi là PS ngoại bào.

Nếu PS ngoại bào bám chặt vào màng tế bào thì được gọi là PS dạng màng bao (nằm trong vùng chu chất). Còn nếu chúng gắn lỏng lẻo hoặc được tiết hoàn toàn ra môi trường 4 thì được gọi là EPS [19], [80]. PS dạng màng bao thường rất khó để tách chiết, tinh chế. Để thu nhận chúng cần phải phá vỡ tế bào và tách ra các phân đoạn cần thiết để loại bỏ các tạp chất khác trước khi kết tủa ethanol (EtOH).

Trong khi đó, PS ngoại bào (EPS), được tiết ra khỏi tế bào, thường dễ dàng tách chiết bằng cách lọc hoặc ly tâm để loại bỏ các tế bào, sau đó kết tủa. EPS có nguồn gốc vi sinh vật đầu tiên được phát hiện từ giữa thế kỷ 19. Đó là dextran, một loại EPS sinh tổng hợp từ Leuconostoc mesenteroides, trong rượu vang. Sau đó, nhiều loại EPS khác nhau đã được tìm ra.

Các nghiên cứu về EPS cho thấy rằng chúng là những PS chuỗi dài, phân nhánh với các đơn vị lặp lại của các loại đường hoặc chất dẫn xuất đường. Các loại đường chủ yếu tham gia cấu tạo nên EPS là gucose (Glc), galactose (Gal) và rhamnose (Rha) với các tỷ lệ khác nhau [25], [78]. Các liên kết tạo nên bộ khung của EPS thường là liên kết 1,4-β- hay liên kết 1,3-β- và 1,2-α- hay các liên kết 1,6-α- và đây thường là cơ sở cho quá trình phân loại EPS [76]. Các EPS thường có khối lượng phân tử cao, không hòa tan hoàn toàn hoặc phân tán trong nước nên có khả năng được sử dụng như chất làm đặc hoặc tạo gel cho các sản phẩm.

Cấu trúc và phân loại exopolysaccharide Thành phần hóa học của EPS từ LAB từ lâu đã là vấn đề gây nhiều tranh cãi. Đầu tiên, Sundman (1953) và Nilsson (1958) đã cho rằng các dạng chất nhờn từ LAB có bản chất giống protein. Sau đó, một số tác giả cho rằng các đặc tính nhớt của sữa lên men là do một glycoprotein hoặc hỗn hợp carbohydrate - protein phức tạp. Các nhà nghiên cứu khác tiếp tục tinh chế các exopolymer này và nhận thấy chúng giàu carbohydrate.

Từ đó, người ta đã có kết luận thống nhất rằng các exopolymer từ LAB là các PS gồm các đơn vị lặp lại, có chứa liên kết α- và β-. Tuy được tạo nên từ nhiều loại monomer nhưng trong các EPS D-Gal, D-Glc và L-Rha hầu như luôn luôn có mặt, nhưng với tỷ lệ khác nhau. Chẳng hạn như, EPS từ L. thermophilus BTC và S.

thermophilus 480 thiếu Rha, EPS từ L. paracasei 34-1 chỉ 5 chứa Gal, EPS từ S. thermophilus OR 901 chỉ chứa Gal và Rha và EPS từ L. sake 0- 1 chỉ bao gồm Glc và Rha.

Ngược lại, EPS được sản xuất bởi L. bulgaricus CRL 420 có chứa Glc và fructose (Fruc) với tỷ lệ 1:2 và các polymer được sản xuất bởi S. thermophilus MR-1C bao gồm một đơn vị cơ bản lặp lại của một octamer gồm D-Gal, L-Rha và L-fucose với tỷ lệ 5:2:1.