Nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase từ chủng Bacillus subtilis phân lập từ đất vườn - Nguyễn Thị Cúc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI -------------------- NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP ENZYM CELLULASE TỪ CHỦNG Bacillus subtilis PHÂN LẬP TỪ ðẤT VƯỜN Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. LƯƠNG ðỨC PHẨM TS. NGUYỄN VĂN GIANG HÀ NỘI - 2014 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các ñề tài khác. Tôi cũng xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược ghi rõ nguồn gốc.

Học viên Nguyễn Thị Cúc Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp i LỜI CẢM ƠN Luận văn này ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. ðể hoàn thành ñược luận văn này tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự ñộng viên, giúp ñỡ của nhiều cá nhân và tập thể. Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới PGS. Lương ðức Phẩm và TS.

Nguyễn Văn Giang người ñã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ks. Phạm Thị Hải, ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học, Ban Quản lý ðào tạo sau ñại học, các Thầy Cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, ñã tạo mọi ñiều kiện và giúp ñỡ tôi về kiến thức cũng như chuyên môn trong suốt 2 năm học tập và làm luận văn.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc ñến gia ñình, bạn bè, những người thân ñã luôn bên tôi, ñộng viên và khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Học viên Nguyễn Thị Cúc Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp ii Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN. ii MỤC LỤC.iv DANH MỤC BẢNG .vii DANH MỤC HÌNH.ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT. ðặt vấn ñề.

Mục ñích của ñề tài. Nội dung ñề tài. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Vi khuẩn Bacillus subtilis.

ðặc ñiểm chung vi khuẩn Bacillus. Vi khuẩn Bacillus subtilis. Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên. Giới thiệu chung về cellulose và enzym cellulase.

Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase ở vi sinh vật. Một số ứng dụng của enzym cellulase. Thu nhận và tinh sạch enzym cellulase từ môi trường nuôi cấy. Tình hình nghiên cứu enzym cellulase.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới. Tình hình nghiên cứu trong nước. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ðối tượng và vật liệu nghiên cứu.

ðối tượng nghiên cứu.29 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iv 3. Thiết bị và dụng cụ. Các phương pháp nghiên cứu. Phương pháp giữ giống.

Xác ñịnh ñặc ñiểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào. Phương pháp xác ñịnh chủng vi khuẩn có hoạt tính enzym cellulase (phương pháp ñịnh tính). Xác ñịnh sự sinh trưởng theo mật ñộ quang. Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ enzym cellulase - CMCase (phương pháp ñịnh lượng) (Ghose TK, 1987).

Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố ñến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố ñến hoạt ñộ CMCase. Phương pháp tách và thu nhận enzym CMCase bằng dung môi hữu cơ (ethanol 960 và aceton). Xác ñịnh ñộ bền nhiệt ñộ của CMCase.

Xác ñịnh ñộ bền pH của CMCase. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzym CMCase. Kết quả tuyển chọn.

Lựa chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính enzym CMCase. Xác ñịnh một số các phản ứng sinh hóa của chủng Bs4. ðường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis Bs4. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố ñến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase.

Lựa chọn chất cảm ứng thích hợp. Ảnh hưởng của nồng ñộ chất cảm ứng CMC. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường. Ảnh hưởng của pH ban ñầu .49 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp v 4.

Ảnh hưởng của nồng ñộ CaCO3. Ảnh hưởng của ñộ thông khí. Ảnh hưởng của thời gian ñến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố ñến hoạt ñộ CMCase.

Nhiệt ñộ phản ứng thích hợp. pH phản ứng thích hợp. Nghiên cứu tách enzym CMCase từ dịch môi trường. Xác ñịnh ñộ bền nhiệt của CMCase.

Xác ñịnh ñộ bền pH của CMCase .59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.61 TÀI LIỆU THAM KHẢO .66 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Một số phản ứng sinh hoá của B. Thành phần hóa học của một số loại phế thải nông nghiệp. Các thiết bị sử dụng trong ñề tài.

Các hoá chất sử dụng trong ñề tài. Phương pháp xác ñịnh hoạt tính một số enzym ngoại bào của Bacillus subtilis. Lượng các chất cho vào trong quá trình thí nghiệm xác ñịnh ñường chuẩn glucose. Lượng các chất cho vào trong quá trình thí nghiệm xác ñịnh hoạt ñộ cellulase.

ðường kính VPG cơ chất CMC của 4 chủng Bs. Kết quả xác ñịnh một số các phản ứng sinh hóa của chủng Bs4. Ảnh hưởng của chất cảm ứng tới khả năng sinh tổng hợp CMCase của chủng Bs4. Ảnh hưởng của nồng ñộ chất cảm ứng CMC ñến khả năng sinh CMCase của chủng Bs4.

Ảnh hưởng của pH ban ñầu ñến khả năng sinh enzym CMCase. Khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase của chủng Bs4 trong môi trường có CaCO3. Ảnh hưởng của ñộ hiếu khí lên khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase của chủng Bs4. Ảnh hưởng của thời gian ñến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase của chủng Bs4.

Ảnh hưởng của nhiệt ñộ phản ứng thích hợp ñến hoạt ñộ CMCase của chủng Bs4. Ảnh hưởng của pH phản ứng thích hợp ñến hoạt ñộ CMCase của chủng Bs4. Thu nhận enzym bằng các dung môi hữu cơ. Kết quả ño hoạt ñộ CMCase theo các dung môi hữu cơ.

ðộ bền nhiệt của CMCase. 58 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp vii Bảng 4. ðộ bền pH của CMCase. 59 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.

Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis. Cấu tạo phân tử cellulose. Cấu trúc của CMC. Cấu trúc của lignocellulose.

Cấu tạo phân tử lignin. Cơ chế hoạt ñộng của endoglucanase (EG). Cơ chế hoạt ñộng của exoglucanase (CBH). Cơ chế hoạt ñộng của β - glucozidase.

Sơ ñồ tác ñộng phân giải của hệ cellulase lên phân tử cellulose (Has G. Mô hình phân hủy cellulose của Lutzen. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào các chủng Bs có hoạt tính enzym ngoại bào. Khả năng thủy phân cơ chất CMC của chủng vi khuẩn Bs4.

ðường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn Bs4 ở 300C. Ảnh hưởng của chất cảm ứng tới khả năng sinh tổng hợp CMCase của chủng Bs4. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường ñến khả năng sinh enzym CMCase. Ảnh hưởng của thời gian ñến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase của chủng Bs4.

53 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CBH : Cellobiohydrolase hay Exoglucanase CBH II : Exoglucanase II CBHI : Exoglucanase I CMC : Cacbon Methyl Cellulose CMCase : Cacbon Methyl Cellulase DNS : Acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic EG : Endoglucanase VddE : Thể tích dung dịch enzym thô Vdm : thể tích dung môi VSV : Vi sinh vật Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp x PHẦN 1. ðặt vấn ñề Vi sinh vật trong tự nhiên rất ña dạng và phong phú. Chúng có mặt khắp nơi: trong ñất, trong nước, trong không khí,…Bên cạnh tác hại gây ra như gây bệnh cho con người, ñộng vật, thực vật…vi sinh vật còn mang lại cho con người nguồn lợi to lớn trong các lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, công nghệ sinh học… Các chủng vi sinh vật nói chung và vi khuẩn Bacillus nói riêng ñang ñược ứng dụng rộng rãi trong các ngành sản xuất là nhờ khả năng sinh các loại enzym thủy phân của chúng. Enzym là những chất xúc tác sinh học có hiệu suất xúc tác cao, ñang ngày càng ñược áp dụng rộng rãi trong thực tế với quy mô ngày càng lớn.

Hệ enzym của Bacillus rất phong phú và ña dạng gồm protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase và chế phẩm enzym cellulase là một trong những chế phẩm enzym có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất hữu cơ trong tự nhiên. Cellulase có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, ñộng vật và vi sinh vật. Nhưng hiệu quả kinh tế nhất vẫn là nguồn cellulase thu ñược từ vi sinh vật, phổ biến là nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn. Mặc dù nấm sợi phân hủy rất tốt các cellulose tự nhiên nhưng vi khuẩn lại có tốc ñộ sinh trưởng cao hơn so với nấm nên có ưu việt lớn hơn.

Trong sản xuất và ñời sống, enzyme nói chung và cellulase nói riêng ñược sử dụng ngày càng phổ biến, sản lượng và kim ngạch mua bán các chế phẩm enzyme trên thị trường thế giới tăng 20÷30% mỗi năm. Enzyme và những chế phẩm có liên quan ñược sử dụng trong các ngành công nghiệp nhẹ, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm ở Việt Nam hiện nay chủ yếu ñược nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao mặc dù nước ta có nguồn phế phẩm nông nghiệp dùng làm nguyên liệu ñể sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú. Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzym từ vi sinh vật phân lập tại Việt Nam hiện nay ñang là một ñòi hỏi cấp thiết. Việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sản xuất enzym nhất là cellulase từ tự nhiên không những giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn gen, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp ñã bị thoái hóa giống sau một thời gian sử dụng.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 1 Xuất phát từ lý do trên và tình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi ñã tiến hành thực hiện ñề tài: ‘‘Nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase từ chủng Bacillus subtilis phân lập từ ñất vườn’’.