Luận án tiến sĩ: E. coli sinh ESBL từ người khỏe mạnh - Kiểu gen và kháng colistin

E. coli là vi khuẩn gram âm hình que, thuộc họ Enterobacteriaceae. Vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong đường ruột người và động vật máu nóng. Hầu hết các chủng E. coli là vi khuẩn hội sinh vô hại. Chúng đóng vai trò quan trọng trong hệ vi sinh đường ruột. Một số chủng đặc biệt có khả năng gây bệnh cho con người. E. coli gây nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng huyết và viêm màng não. Khả năng sinh ESBL làm tăng nguy cơ thất bại điều trị.

ESBL là nhóm enzyme beta-lactamase có phổ hoạt động mở rộng. Enzyme này thủy phân vòng beta-lactam của kháng sinh, làm mất hoạt tính kháng khuẩn. Gen blaCTX-M là gen ESBL phổ biến nhất hiện nay. Gen blaTEM và gen blaSHV cũng được phát hiện thường xuyên. Các gen này thường nằm trên plasmid kháng thuốc, dễ dàng truyền giữa các vi khuẩn. Cơ chế này giải thích sự lây lan nhanh chóng của tính kháng thuốc trong quần thể vi khuẩn.

E. coli sinh ESBL gây khó khăn lớn trong điều trị nhiễm trùng. Các kháng sinh thông thường như cephalosporin thế hệ ba không còn hiệu quả. Bệnh nhân nhiễm vi khuẩn này có nguy cơ tử vong cao hơn. Thời gian nằm viện kéo dài và chi phí điều trị tăng đáng kể. Carbapenem từng là lựa chọn cuối cùng cho các trường hợp này. Tuy nhiên, tình trạng kháng carbapenem cũng đang gia tăng đáng báo động.

Gen blaCTX-M hiện là gen ESBL phổ biến nhất trên thế giới. Họ gen này được chia thành 5 nhóm chính dựa trên trình tự amino acid. Nhóm CTX-M-1 và CTX-M-9 chiếm tỷ lệ cao nhất. Gen này mã hóa enzyme có khả năng thủy phân cefotaxime mạnh mẽ. CTX-M-15 là biến thể phổ biến nhất ở nhiều quốc gia. Sự lây lan nhanh chóng của blaCTX-M liên quan đến các dòng vô tính E. coli thành công như ST131. Plasmid mang gen này dễ dàng truyền ngang giữa các loài vi khuẩn khác nhau.

Gen blaTEM được phát hiện đầu tiên vào năm 1965. TEM-1 và TEM-2 là các biến thể beta-lactamase phổ hẹp phổ biến. Các đột biến điểm tạo ra các biến thể ESBL như TEM-3, TEM-10. Gen blaSHV có nguồn gốc từ nhiễm sắc thể của Klebsiella pneumoniae. SHV-1 là enzyme beta-lactamase phổ hẹp tự nhiên. Các đột biến tạo ra SHV-2, SHV-5 với khả năng thủy phân kháng sinh mở rộng. Tuy nhiên, tần suất gen blaTEM và blaSHV đang giảm so với blaCTX-M trong những năm gần đây.

PCR là phương pháp tiêu chuẩn để phát hiện gen ESBL. Kỹ thuật này sử dụng các mồi đặc hiệu cho từng họ gen. Giải trình tự DNA xác định chính xác biến thể gen cụ thể. Multiplex PCR cho phép phát hiện đồng thời nhiều gen trong một phản ứng. Whole genome sequencing cung cấp thông tin toàn diện về kiểu gen kháng thuốc. Phương pháp này còn xác định được vị trí gen trên nhiễm sắc thể hay plasmid. Công nghệ real-time PCR giúp định lượng số lượng bản sao gen.

Colistin thuộc nhóm kháng sinh polymyxin, được phát hiện từ năm 1947. Kháng sinh này bị bỏ quên nhiều thập kỷ do độc thận và độc thần kinh. Sự gia tăng vi khuẩn kháng carbapenem khiến colistin được tái sử dụng. Cơ chế hoạt động của colistin là phá vỡ màng tế bào vi khuẩn gram âm. Thuốc liên kết với lipopolysaccharide, tạo lỗ trên màng tế bào. Colistin vẫn giữ vai trò quan trọng trong điều trị nhiễm trùng nặng. Tuy nhiên, tính kháng colistin đang gia tăng đáng lo ngại.

Gen mcr-1 được phát hiện đầu tiên ở Trung Quốc năm 2015. Gen này nằm trên plasmid, dễ dàng lây lan giữa các vi khuẩn. Hiện đã phát hiện 10 biến thể gen mcr từ mcr-1 đến mcr-10. Gen mcr-1 phổ biến nhất, được tìm thấy trên nhiều loài Enterobacteriaceae. Enzyme MCR-1 thêm nhóm phosphoethanolamine vào lipid A. Sự biến đổi này làm giảm điện tích âm của màng tế bào. Kết quả là colistin không thể liên kết và phát huy tác dụng kháng khuẩn.

Sự kết hợp giữa ESBL và kháng colistin tạo ra vi khuẩn cực kỳ nguy hiểm. E. coli mang cả gen ESBL và mcr-1 đã được phát hiện trên toàn thế giới. Tỷ lệ này thay đổi tùy theo khu vực địa lý và điều kiện sử dụng kháng sinh. Ở một số quốc châu Á, tỷ lệ có thể lên đến 5-10%. Việc phát hiện gen mcr-1 ở người khỏe mạnh đặc biệt đáng lo ngại. Điều này cho thấy sự lây lan âm thầm trong cộng đồng. Cần có biện pháp giám sát và kiểm soát nghiêm ngặt hơn.

Vi khuẩn đa kháng thuốc (MDR) kháng ít nhất ba nhóm kháng sinh. Vi khuẩn kháng mở rộng (XDR) kháng hầu hết các nhóm kháng sinh. Vi khuẩn toàn kháng (PDR) kháng tất cả các kháng sinh hiện có. E. coli sinh ESBL thường có kiểu hình MDR hoặc XDR. Các nhóm kháng sinh thường bị kháng đồng thời bao gồm fluoroquinolone, aminoglycoside, sulfonamide. Cơ chế đa kháng liên quan đến nhiều gen kháng thuốc trên cùng plasmid. Hiện tượng này làm phức tạp việc lựa chọn kháng sinh điều trị.

Gen kháng fluoroquinolone như qnrA, qnrB, qnrS thường xuất hiện cùng gen ESBL. Đột biến trong gen gyrA và parC cũng gây kháng quinolone. Gen kháng aminoglycoside bao gồm aac, aph, ant với nhiều biến thể. Gen sul1, sul2 mã hóa kháng sulfonamide rất phổ biến. Gen tet(A), tet(B) gây kháng tetracycline thường được phát hiện. Các gen này thường cùng nằm trên plasmid với gen ESBL. Sự kết hợp này tạo ra vi khuẩn kháng đồng thời nhiều loại kháng sinh khác nhau.

Plasmid là phân tử DNA vòng tồn tại độc lập với nhiễm sắc thể. Plasmid kháng thuốc mang nhiều gen kháng sinh khác nhau. Chúng có khả năng tự nhân đôi và truyền giữa các tế bào vi khuẩn. Quá trình tiếp hợp là cơ chế chính của truyền ngang plasmid. Plasmid IncF, IncI, IncN là các nhóm phổ biến mang gen ESBL. Một plasmid có thể mang đồng thời gen ESBL, mcr-1 và nhiều gen kháng thuốc khác. Khả năng truyền ngang cao giải thích sự lây lan nhanh chóng của kháng thuốc.

Adhesin là protein bề mặt giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào vật chủ. Fimbriae type 1 (gen fimH) giúp bám dính vào tế bào biểu mô đường tiết niệu. P fimbriae (gen papC) đặc trưng cho E. coli gây viêm thận bể thận. S fimbriae (gen sfa) liên quan đến viêm màng não và nhiễm trùng huyết. Dr adhesin (gen draE) gây nhiễm trùng đường tiết niệu tái phát. Curli (gen csgA) tham gia hình thành biofilm. Khả năng bám dính là bước đầu tiên trong quá trình gây bệnh của E. coli.

Hemolysin (gen hlyA) phá vỡ tế bào hồng cầu và tế bào biểu mô. Cytotoxic necrotizing factor (gen cnf1) gây hoại tử tế bào. Shiga toxin (gen stx) gây xuất huyết ruột và hội chứng tán huyết urê. Enterotoxin gây tiêu chảy bằng cách tăng tiết dịch ruột. Toxin LT và ST là đặc trưng của E. coli gây tiêu chảa du lịch. Các toxin này góp phần quan trọng vào triệu chứng lâm sàng. Mức độ biểu hiện toxin ảnh hưởng đến mức độ nặng của bệnh.

Sắt là yếu tố thiết yếu cho sự sinh trưởng của vi khuẩn. Aerobactin (gen iucC) là siderophore giúp thu nhận sắt hiệu quả. Yersiniabactin (gen fyuA) tăng khả năng sống sót trong máu. Salmochelin (gen iroN) giúp vi khuẩn cạnh tranh sắt với vật chủ. Protein kháng huyết thanh (gen traT, iss) bảo vệ vi khuẩn khỏi hệ bổ thể. Vi nang (gen kpsM) ngăn cản sự thực bào của bạch cầu. Các yếu tố này giúp E. coli tồn tại và sinh sản trong cơ thể vật chủ.

Mẫu phân được thu thập từ người khỏe mạnh trong cộng đồng. Bệnh phẩm ngoài ruột bao gồm nước tiểu, máu, mủ, dịch cơ thể. Mẫu được cấy trên môi trường MacConkey agar chọn lọc. Khuẩn lạc màu hồng đỏ lên men lactose được chọn. Định danh sơ bộ dựa trên test IMViC và API 20E. Xác nhận E. coli bằng PCR phát hiện gen uidA mã hóa beta-glucuronidase. Các chủng E. coli được bảo quản ở -80°C trong glycerol 20% cho nghiên cứu tiếp theo.

Test sàng lọc ESBL sử dụng đĩa cefpodoxime, ceftazidime, cefotaxime. Test xác nhận ESBL dùng phương pháp kết hợp với acid clavulanic. Tăng đường kính vùng ức chế ≥5mm xác nhận ESBL dương tính. PCR phát hiện gen blaCTX-M, blaTEM, blaSHV với mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1.5%. Giải trình tự Sanger xác định chính xác biến thể gen ESBL. Phân tích trình tự sử dụng BLAST so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank.

Gen mcr-1 đến mcr-10 được phát hiện bằng multiplex PCR. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của colistin bằng phương pháp pha loãng nước thịt. MIC ≥4 μg/mL được coi là kháng colistin theo tiêu chuẩn EUCAST. Phát hiện gen mã hóa yếu tố độc lực bằng PCR với 20-30 cặp mồi. Các gen được phân loại theo chức năng: adhesin, toxin, siderophore. Phân tích thống kê sử dụng SPSS với test Chi-square và Fisher exact. Giá trị p <0.05 được coi là có ý nghĩa thống kê.