Computational discovery of viruses and their hosts
Computational discovery of viruses and their hosts using bioinformatics and machine learning techniques.
University of Amsterdam
Tin sinh học và Virus học
Luan An
Luận án
Năm xuất bản
Số trang
167
Thời gian đọc
26 phút
Lượt xem
0
Lượt tải
0
Phí lưu trữ
50 Point
Tổng quan nhanh
- Chủ đề:
- Unveiling Viruses: Computational Methods for Discovery
- Số trang:
- 167 trang
- Trường:
- University of Amsterdam
- Chuyên ngành:
- Tin sinh học và Virus học
- Tác giả:
- Cormac M. Kinsella
- Năm:
- 2023
Tóm tắt nội dung luận án
I.Unveiling Viruses Computational Methods for Discovery
The field of virology significantly benefits from computational approaches. Historically, virus identification relied on specific filtration methods, distinguishing them from larger microbial pathogens. Early understanding considered viruses as non-bacterial, often liquid-like agents. Modern computational discovery leverages advanced technologies to overcome limitations of traditional culture-based methods. This research focuses on developing and applying sophisticated bioinformatics tools for comprehensive viral detection and identification. It explores diverse viral landscapes, moving beyond previously unculturable entities. Genomic sequencing data provides a rich source for uncovering novel viruses and their genetic characteristics. This computational framework accelerates pathogen discovery, offering insights into viral diversity and evolution. Understanding viral pathogenesis begins with accurate detection. The integration of bioinformatics into virological research marks a paradigm shift in how infectious agents are identified and studied. This facilitates a deeper understanding of host-pathogen interactions across various ecosystems.
1.1. Evolution of virus concept and initial challenges
The term "virus" originally denoted a non-specific poison. Nineteenth-century science identified bacteria and fungi as disease agents through culturing. A critical shift occurred in 1898, recognizing a distinct class of disease agents smaller than bacteria. These agents passed through bacterial filters. Early research by Loeffler, Frosch, and Beijerinck established this foundational understanding. They identified agents causing foot-and-mouth disease and tobacco mosaic disease. This early work challenged existing microbial paradigms. It paved the way for modern virology, focusing on sub-cellular infectious particles. The concept evolved from a liquid-like entity to a particulate agent capable of replication. This historical context underlines the continuous need for advanced methods in pathogen discovery. Traditional limitations inspired innovative computational solutions.
1.2. Advanced bioinformatics for viral pathogen detection
Bioinformatic profiling significantly enhances viral detection. Next-generation sequencing (NGS) generates vast amounts of genetic data. Computational algorithms analyze this data for viral signatures. Specific protocols, like VIDISCA libraries, undergo enhanced bioinformatic analysis. This allows for sensitive and broad-spectrum virus discovery. Metagenomic approaches identify viruses without prior knowledge of their sequences. Sequence alignment, de novo assembly, and homology searches are crucial steps. These methods differentiate viral genetic material from host or environmental background. The computational pipeline identifies known and novel viral species. This contributes to a more complete viral catalog. Accurate bioinformatics tools are essential for public health surveillance and understanding emerging infectious diseases.
II.Exploring Viral Host Prediction and Interactions
Understanding viral host range is fundamental to disease ecology. Computational models are pivotal in predicting host-virus interactions. This research investigates the complex relationships between viruses and their diverse hosts. Specific focus areas include identifying novel hosts for known viral groups. This involves analyzing genomic data from potential hosts and viral sequences. Predictive algorithms correlate viral genomic features with host characteristics. The findings contribute significantly to virology and microbial ecology. Accurately assigning hosts to viruses informs disease transmission pathways. It aids in assessing zoonotic potential. This approach moves beyond simple detection to functional understanding. Host prediction provides crucial context for viral evolution and pathogenicity studies. Computational biology offers powerful tools for unraveling these intricate ecological links.
2.1. Uncovering CRESS viruses in parasitic hosts
CRESS viruses represent a significant group of circular replication-associated protein (Rep) encoding single-stranded DNA viruses. Their host range is often broad and poorly understood. This study implicates specific parasites, Entamoeba and Giardia, as hosts for CRESS viruses. Metagenomic sequencing data from these parasites reveals viral sequences. This discovery expands the known ecological niche of CRESS viruses. It suggests novel pathways for viral transmission within microbial communities. Understanding these host associations is critical for studying parasitic infections. The presence of CRESS viruses in common human parasites could have implications for coinfections. This research highlights the power of computational screening in host-pathogen studies.
2.2. Predictive models for gastrointestinal virus hosts
Gastrointestinal cressdnaviruses are frequently associated with human health. Predicting their hosts is challenging due to the complexity of the gut microbiome. Computational methods are developed to link these viruses to specific host organisms. These models integrate viral genetic information with host metagenomic profiles. Machine learning algorithms contribute to improved predictive accuracy. Host prediction for these disease-associated viruses has significant diagnostic and epidemiological value. It clarifies potential reservoirs and transmission dynamics. This research provides a framework for identifying new gastrointestinal viral pathogens. The findings enhance understanding of the human gut virome and its impact on health.
III.Deciphering Vertebrate Tropism Viral Evolution
The adaptation of viruses to vertebrate hosts presents a major research area. Viral tropism, the specific affinity for certain host cells or tissues, dictates disease patterns. This research delves into the mechanisms driving vertebrate tropism, particularly for cressdnaviruses. It investigates how these viruses acquire genetic material that facilitates host shifts. Computational analyses reveal evolutionary events like gene capture. Gene capture events can significantly alter a virus's host range or pathogenicity. Understanding these processes is crucial for predicting emerging zoonotic diseases. The study utilizes advanced molecular biology and genomic sequencing data. It provides insights into the evolutionary trajectories of viruses. This knowledge base helps develop strategies for disease prevention and control.
3.1. Investigating cressdnavirus adaptation in vertebrates
Cressdnaviruses exhibit diverse host associations. This study focuses on a specific lineage demonstrating vertebrate tropism. Computational genomic comparisons reveal genetic signatures of adaptation. These adaptations allow viruses to infect and replicate within vertebrate cells. Analyzing viral genomes provides clues about their evolutionary journey. Understanding host-specific adaptation is vital for assessing zoonotic risk. The identification of vertebrate-tropic cressdnaviruses expands knowledge of viral ecology. This contributes to a broader understanding of viral evolution and host range expansion.
3.2. Role of gene capture in viral host shifts
Gene capture, a process where viruses acquire genetic material from other viruses or hosts, profoundly impacts evolution. This research highlights poxvirus gene capture as a mechanism for cressdnavirus vertebrate tropism. The captured genes provide new functions, potentially aiding replication or immune evasion in vertebrate hosts. Computational phylogenetic analyses trace these acquisition events. This molecular mechanism illustrates rapid viral evolution and host switching. It underscores the dynamic nature of viral genomes. Understanding gene capture informs strategies for predicting viral emergence.
IV.Identifying Mycoviruses in Human Pathogenic Fungi
Fungi pose significant health challenges, especially in immunocompromised individuals. Mycoviruses, viruses infecting fungi, can alter fungal pathogenicity and host interactions. This research focuses on the computational discovery of diverse mycoviruses within human clinical isolates of pathogenic fungi. It employs advanced genomic sequencing and bioinformatic pipelines to characterize these fungal viruses. The presence and diversity of mycoviruses in clinical settings are often overlooked. This study sheds light on their prevalence and potential impact on fungal virulence. Understanding mycovirus-fungus relationships is critical for developing new antifungal strategies. It also opens avenues for biological control of fungal pathogens. The comprehensive identification of mycoviruses expands the known fungal virome.
4.1. Discovery of diverse mycoviruses in clinical fungi
Human clinical isolates of pathogenic fungi host a surprising diversity of mycoviruses. Metagenomic sequencing of these isolates enables broad-spectrum mycovirus detection. This research identifies numerous novel and previously characterized mycoviruses across various fungal species. The discovered mycoviruses belong to different viral families. Their genomic characteristics are analyzed computationally. This systematic discovery provides a comprehensive catalog of mycoviruses associated with human fungal infections. It highlights the widespread nature of these fungal pathogens.
4.2. Impact of mycoviruses on fungal pathogenicity
Mycoviruses can significantly modulate the virulence of their fungal hosts. Some mycoviruses attenuate fungal pathogenicity, while others enhance it. This research explores the potential implications of identified mycoviruses on the virulence of clinical fungal isolates. While direct experimental validation is beyond the scope, the discovery sets the stage for future functional studies. Understanding these interactions offers novel therapeutic targets. It could lead to strategies using mycoviruses as biocontrol agents against pathogenic fungi. The interplay between virus, fungus, and human host represents a complex ecosystem.
V.Advancing Computational Virology and Public Health
Computational methods are transforming virology, accelerating pathogen discovery and host prediction. This body of work consolidates findings on enhanced bioinformatics for viral detection, host prediction, and evolutionary insights. It highlights the critical role of next-generation sequencing and sophisticated algorithms in uncovering novel viruses and their ecological relationships. The research significantly contributes to understanding complex host-pathogen interactions across diverse biological systems, from parasitic protozoa to human pathogenic fungi and vertebrates. The synthetic approach empowers researchers to tackle emerging infectious diseases more effectively. It provides a robust framework for surveillance, diagnosis, and intervention strategies. The integration of computational biology with traditional virology strengthens public health defenses. This continuous advancement promises improved outcomes in global health.
5.1. Synthesizing computational discovery advancements
This research synthesizes multiple studies demonstrating the power of computational tools in virus discovery. It showcases successful applications of bioinformatic profiling for identifying novel viruses. The work establishes methodologies for predicting viral hosts with higher accuracy. Findings across different viral groups—cressdnaviruses and mycoviruses—illustrate broad applicability. The integration of genomic and metagenomic data analysis defines a new era in virological research. This synthesis provides a comprehensive overview of current capabilities in computational virology. It underlines the crucial role of interdisciplinary approaches.
5.2. Future directions in viral detection and host prediction
The advancements presented open numerous avenues for future research. Continuous refinement of bioinformatic algorithms promises even more sensitive viral detection. Incorporating artificial intelligence and machine learning will further enhance host prediction models. Expanding surveillance efforts to diverse environmental and clinical samples is crucial. Future studies will focus on functional validation of predicted host-virus interactions. This includes experimental work to confirm pathogenicity and tropism. The development of integrated platforms for rapid, real-time viral discovery will be essential for global health security.
Mục lục chi tiết luận án
Tải xuống file đầy đủ để xem toàn bộ nội dung
Tải đầy đủ (167 trang)Nội dung chính
Tổng quan về luận án
Sự bùng nổ của công nghệ giải trình tự thông lượng cao (High-Throughput Sequencing - HTS) và siêu hệ gen (metagenomics) đã thúc đẩy một cuộc cách mạng trong việc giải mã thế giới virus (virosphere), cho phép phát hiện hàng trăm nghìn bộ gen virus chưa từng được nuôi cấy. Tuy nhiên, nghịch lý lớn nhất của vi sinh vật học hiện đại chính là "vấn đề định danh vật chủ" (the host identity problem) khi phần lớn các hạt virus được định danh trong metagenomics ở trạng thái "virus vô gia cư" (stray viruses) – tức biết rõ trình tự hệ gen nhưng hoàn toàn khuyết thiếu thông tin về tế bào vật chủ sinh học. Luận án tiến sĩ "Computational discovery of viruses and their hosts" của tác giả Cormac M. Kinsella (Đại học Amsterdam, 2023) đặt nền móng tiên phong giải quyết nút thắt này thông qua việc thiết lập hệ thống phương pháp tính toán sinh học (bioinformatics) đa tầng kết hợp phân tích tương tác tiến hóa phân tử.
Khoảng trống nghiên cứu (research gap) trọng tâm mà luận án giải quyết là sự thiếu hụt các công cụ xác định vật chủ mà không cần phụ thuộc vào dữ liệu huấn luyện máy học có sẵn hoặc việc cô lập vật chủ trong phòng thí nghiệm (Kinsella, 2023; Shi et al., 2016). Các câu hỏi và giả thuyết nghiên cứu được cụ thể hóa:
- Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Liệu các đặc trưng sinh học phân tử từ kỹ thuật chuẩn bị thư viện VIDISCA-NGS (như việc cắt đặc hiệu bằng enzyme giới hạn Mse1) có thể chuyển hóa thành thuật toán tin sinh học nhằm phát hiện virus phân kỳ cao không phụ thuộc vào độ tương đồng trình tự (homology)?
- Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Phân họ virus DNA sợi đơn dạng vòng mã hóa protein Rep (Cressdnaviricota) chưa phân loại trong đường tiêu hóa người ký sinh trên chính tế bào người hay trên các sinh vật đơn bào nhân thực (protozoan parasites)?
- Giả thuyết 1 (H1): Mức độ tái lặp của các đoạn cắt giới hạn enzyme Mse1 tạo ra tín hiệu gom cụm sinh học (read clustering) tỷ lệ thuận trực tiếp với tải lượng virus thực tế ($p < 0.001$).
- Giả thuyết 2 (H2): Mạng lưới tái tổ hợp mô-đun (modular recombination) giữa các gen Rep và Cap đóng vai trò như dấu chỉ sinh học xác thực vật chủ chung giữa các dòng virus phân kỳ.
Khung lý thuyết của luận án tích hợp Thuyết tiến hóa mô-đun của virus (Modular Virus Evolution Theory - Botstein, 1980), Thuyết đồng tiến hóa virus - vật chủ (Virus-Host Co-evolutionary Theory - Ehrlich & Raven, 1964; Forterre, 2006) và Nguyên lý thiên lệch sử dụng bộ ba mã hóa (Codon Usage Bias Theory - Sharp & Li, 1987). Đột phá định lượng của nghiên cứu được thể hiện qua việc phát hiện và định danh chính thức 3 họ virus mới thuộc ngành Cressdnaviricota (Naryaviridae, Nenyaviridae, Vilyaviridae được Ủy ban Quốc tế về Phân loại Virus - ICTV công nhận), phân tích trên 374 mẫu phân lâm sàng người từ 2 đoàn hệ độc lập và 29 mẫu huyết thanh lợn, mở rộng hiểu biết về phổ vật chủ của virus DNA sợi đơn sang giới nguyên sinh động vật (Protozoa).
Literature Review và Positioning
Lịch sử vi sinh học từ cuối thế kỷ XIX với các công trình kinh điển của Friedrich Loeffler và Paul Frosch (1898) về tác nhân gây bệnh lở mồm long móng, cùng Martinus Beijerinck (1898) với khái niệm "chất lỏng truyền nhiễm sống" (contagium vivum fluidum) đã đặt ra nguyên lý virus gắn liền với bệnh cảnh lâm sàng của vật chủ. Trong suốt thế kỷ XX, từ kỹ thuật mảng bọc (plaque assay) của Félix d'Hérelle (1917) đến giải trình tự Sanger hệ gen $\phi$X174 (Sanger et al., 1977), nhận thức về virus luôn vận hành theo mô hình "vật chủ trước - virus sau" (host-first).
Sự trỗi dậy của metagenomic HTS vào đầu những năm 2000 đã đảo ngược hoàn toàn trật tự này thành "virus trước - vật chủ sau" (Rosario et al., 2012; Zhao et al., 2019). Trong y văn quốc tế tồn tại hai luồng quan điểm đối lập sâu sắc:
- Luồng quan điểm thứ nhất (Host-centric view): Cho rằng các virus ssDNA mới phát hiện trong mẫu lâm sàng của người (như đường tiêu hóa, máu, dịch hô hấp) là tác nhân gây bệnh trực tiếp trên tế bào người hoặc liên quan đến các bệnh lý viêm nhiễm mạn tính (Abbas et al., 2019; Zhang et al., 2018).
- Luồng quan điểm thứ hai (Spillover/Bystander view): Lập luận rằng hệ virome đường ruột chứa đựng vật chất di truyền từ chế độ ăn, vi khuẩn và ký sinh trùng, dẫn đến nguy cơ quy kết sai lệch quan hệ nhân quả bệnh học (Krupovic et al., 2020; Simmonds et al., 2017).
Luận án của Kinsella định vị chính xác vào điểm giao thoa này, giải quyết tranh luận bằng cách chứng minh các chuỗi virus CRESS chưa phân loại phân lập từ mẫu phân người thực chất không lây nhiễm tế bào biểu mô ruột người mà lây nhiễm các ký sinh trùng đơn bào nội sinh (Entamoeba và Giardia). Luận án tạo bước tiến vượt trội so với hai nghiên cứu quốc tế điển hình:
- So với nghiên cứu của Abbas et al. (2019) về họ Redondoviridae (vốn chỉ dừng lại ở liên kết dịch tễ học với bệnh viêm nha chu và bệnh nhân hồi sức tích cực mà không xác định được tế bào đích), Kinsella thiết lập khung phân tích sinh học tính toán chứng minh Redondoviridae thực chất ký sinh trên Entamoeba gingivalis.
- So với nghiên cứu của Kazlauskas et al. (2019) phân loại các nhóm CRESSV1–CRESSV6 dựa thuần túy trên phát sinh loài của protein Rep, Kinsella kết hợp mạng lưới tái tổ hợp mô-đun Rep-Cap và phân tích các yếu tố virus nội sinh (Endogenous Viral Elements - EVEs) để neo các nhánh virus này vào các chi vật chủ chính xác như Blastocystis và Endolimax.
Đóng góp lý thuyết và khung phân tích
Đóng góp cho lý thuyết
Nghiên cứu của Kinsella mở rộng Thuyết tiến hóa mô-đun (Modular Evolution Theory) của Botstein (1980) và Hendrix et al. (1999) sang thế giới virus nhân thực ssDNA. Bằng chứng thực nghiệm từ dữ liệu giải trình tự chỉ ra sự hoán đổi hoàn chỉnh giữa các mô-đun gen chức năng:
- Mô hình lý thuyết 1 (Proposition 1): Các dòng virus có protein Rep tương đồng cao có thể liên kết với các vỏ capsid (Cap) có nguồn gốc tiến hóa hoàn toàn dị biệt nếu chúng nhân lên trong cùng một không gian nội bào vật chủ.
- Mô hình lý thuyết 2 (Proposition 2): Sự đồng tiến hóa về thành phần nucleotide biểu hiện qua tương quan tuyến tính dương giữa hàm lượng GC của virus và vật chủ ($r^2 = 0.52, p < 0.01$), phản ánh áp lực chọn lọc từ tính sẵn có của tRNA vật chủ (Codon Usage Bias Theory).
- Chuyển dịch hệ hình (Paradigm shift): Phân tích phát sinh loài Rep chứng minh các dòng CRESS virus lây nhiễm sinh vật đa bào (thực vật, động vật có xương sống) đã tiến hóa độc lập ít nhất ba lần từ các tổ tiên đơn bào nguyên thủy, thách thức giả thuyết cho rằng virus ssDNA nhân thực có nguồn gốc đơn phát sinh từ vi khuẩn.
Khung phân tích độc đáo
Khung phân tích của luận án tích hợp ba trụ cột lý thuyết: Hệ thống học phân tử (Phylogenetics), Sinh học hệ gen nội sinh (Paleovirology & EVEs) và Sinh thái học vi sinh vật (Microbial Ecology).
+-------------------------------------------------------+
| Khung phân tích nhận diện tương tác Virus-Host |
+-------------------------------------------------------+
|
+-------------------------------------------+-------------------------------------------+
| | |
v v v
+---------------------------+ +---------------------------+ +---------------------------+
| Trụ cột 1: Tương quan | | Trụ cột 2: Dấu ấn sinh | | Trụ cột 3: Mạng lưới |
| Lâm sàng & Dịch tễ | | học Hệ gen (EVEs) | | Tái tổ hợp Mô-đun |
| - Chi-squared test | | - Tích hợp hệ gen ký | | - Phân tích tương quan |
| - Tương quan GC-content | | sinh trùng | ch chéo giữa Rep & Cap |
| - Case-control cohorts | | - Dấu ấn small RNA | - Nhận diện CRESS Cap |
| | | (bẫy AGO2-2) | Assemblages (CCAs) |
+---------------------------+ +---------------------------+ +---------------------------+
| | |
+-------------------------------------------+-------------------------------------------+
|
v
+-------------------------------------------------------+
| Xác định chính xác Vật chủ (Host Prediction) |
| *Naryaviridae/Nenyaviridae* -> *Entamoeba* |
| *Vilyaviridae* -> *Giardia duodenalis* |
+-------------------------------------------------------+
Khung phân tích đưa ra khái niệm "CRESS virus Cap assemblages" (CCAs) nhằm phân loại các họ protein vỏ không tương đồng: CCA1 (~467 axit amin) và CCA2 (~180 axit amin) luân chuyển tự do giữa các họ Naryaviridae và Nenyaviridae, trong khi CCA3 đặc hiệu tuyệt đối cho Vilyaviridae. Điều kiện biên (boundary conditions) của khung phân tích được xác định rõ: phương pháp đạt độ chính xác tối đa khi có sự hiện diện của các vết tích hội nhập gen (EVEs) hoặc hiện tượng tái tổ hợp chéo, và phụ thuộc vào tính hoàn chỉnh của dữ liệu hệ gen tham chiếu.
Phương pháp nghiên cứu tiên tiến
Thiết kế nghiên cứu
Luận án áp dụng lập trường nhận thức luận thực chứng phản biện (Critical Realism) kết hợp thiết kế đa phương pháp định lượng nghiêm ngặt (Quantitative Mixed Computational-Experimental Design). Thiết kế nghiên cứu đa tầng bao gồm:
- Cấp độ phân tử: Phân tích hóa sinh các thư viện làm giàu virus VIDISCA-NGS (Virus Discovery cDNA-AFLP NGS).
- Cấp độ hệ gen: Lắp ráp de novo, phân tích tương đồng protein từ xa bằng mô hình Hidden Markov (HMM).
- Cấp độ quần thể/lâm sàng: Đánh giá dịch tễ học bệnh chứng trên cỡ mẫu thực tế.
Cỡ mẫu nghiên cứu xác định chuẩn xác:
- Đoàn hệ 1 (Cohort 1): 194 mẫu phân từ bệnh nhân nhiễm HIV-1 người lớn kèm tiêu chảy không rõ nguyên nhân (thu thập 1994–1995 tại Trung tâm Y tế Đại học Amsterdam - AMC).
- Đoàn hệ 2 (Cohort 2): 180 mẫu phân từ đoàn hệ nghiên cứu tiến cứu Amsterdam Cohort Studies (ACS) gồm 85 cá nhân HIV-1 dương tính và 95 cá nhân HIV-1 âm tính thuộc nhóm nam quan hệ tình dục đồng giới (MSM). Tổng cỡ mẫu người là $N = 374$.
- Đoàn hệ động vật: 29 mẫu huyết thanh lợn gồm 13 nái và 16 lợn con nhiễm virus dịch tả lợn không điển hình (Atypical Porcine Pestivirus - APPV).
Quy trình nghiên cứu rigorous
Quy trình tiền xử lý và tách chiết tuân thủ tiêu chuẩn phòng sạch vi sinh: huyền phù phân 1:3 được ly tâm (5000 g trong 10 phút) lắng cặn tế bào, dịch nổi được xử lý với $20\ \mu\text{l}$ TURBO DNase ($37^\circ\text{C}$, 30 phút) nhằm phân hủy triệt để DNA trần của vật chủ và vi khuẩn. Tách chiết nucleic acid bằng phương pháp hạt silica Boom (Boom et al., 1990). Phiên mã ngược sử dụng non-ribosomal hexamer primers để triệt tiêu việc khuếch đại rRNA của động vật có vú.
+-------------------------------------------------------------------------+
| Mẫu phân lâm sàng (N = 374: Cohort 1 = 194, Cohort 2 = 180) |
+-------------------------------------------------------------------------+
|
v
+-------------------------------------------------------------------------+
| Tiền xử lý & Làm giàu hạt Virus: |
| - Ly tâm 5000 g loại bỏ cặn tế bào |
| - Xử lý TURBO DNase loại bỏ DNA trần |
| - Tách chiết Boom method & Phiên mã ngược với non-rRNA hexamers |
+-------------------------------------------------------------------------+
|
v
+-------------------------------------------------------------------------+
| Tạo thư viện VIDISCA-NGS: |
| - Cắt enzym Mse1 (vị trí TTAA) tạo đoạn biological replicates |
| - Gắn adapter, khuếch đại PCR & Size selection (200-600 bp) |
| - Giải trình tự Ion Torrent PGM (Cohort 1) & Illumina MiSeq (Cohort 2) |
+-------------------------------------------------------------------------+
|
v
+-------------------------------------------------------------------------+
| Pipeline Tin sinh học VIDISCA-e: |
| - Lọc rRNA bằng SortMeRNA v2.1 |
| - Gom cụm 100% identity bằng CD-HIT v4.7 -> Cluster-profiling analysis |
| - Tìm kiếm tương đồng protein: UBLAST (USEARCH v10) & pHMMER |
| - Loại trừ âm tính giả qua BLASTn so với NCBI nt |
| - Lắp ráp SPAdes v3.12, Inverse PCR & Giải trình tự Sanger |
+-------------------------------------------------------------------------+
|
v
+-------------------------------------------------------------------------+
| Xác thực tích hợp Sinh học: |
| - Kiểm tra vỏ capsid: Lọc qua màng 200 nm + xử lý DNase + PCR |
| - Phân tích EVEs trên contig Entamoeba & Giardia |
| - Đối chiếu đáp ứng ức chế miễn dịch qua small RNA (phức hợp AGO2-2) |
+-------------------------------------------------------------------------+
Độ tin cậy và giá trị khoa học (validity & triangulation):
- Tam giác hóa phương pháp (Methodological Triangulation): Kết hợp giải trình tự đoạn ngắn NGS (Ion Torrent, Illumina), giải trình tự đoạn dài Oxford Nanopore, PCR nghịch đảo (inverse PCR), giải trình tự Sanger và xét nghiệm chẩn đoán phân tử qPCR (nhắm vào gen 18S rRNA của ký sinh trùng).
- Chứng minh tính nguyên vẹn của hạt virus: Dịch nổi lọc qua màng 1200 nm và 200 nm, xử lý với DNase, sau đó khuếch đại PCR thành công chứng minh DNA virus ngoại sinh được bao bọc an toàn trong cấu trúc protein capsid hoàn chỉnh.
Data và phân tích
Dữ liệu được phân tích qua pipeline tin sinh học tùy biến VIDISCA-e với các phần mềm chuyên dụng:
- SortMeRNA v2.1: Tách lọc toàn bộ đoạn đọc ribosomal RNA.
- CD-HIT v4.7: Gom cụm đoạn đọc non-rRNA ở ngưỡng 100% identity nhằm đo lường mức độ trùng lặp sinh học (biological redundancy).
- USEARCH v10 (UBLAST): Căn chỉnh nhanh chuỗi protein với các tham số
-mincodons 15,-accel 0.8,-evalue 1e-4đối chiếu cơ sở dữ liệu protein virus NCBI rút gọn (thu hẹp kích thước 81%). - BLASTn & BLASTx (BLAST+ v2.0): Loại trừ dương tính giả (false positive removal) bằng cách truy vấn ngược với cơ sở dữ liệu NCBI nt.
- SPAdes v3.12: Lắp ráp de novo hệ gen virus.
- BWA-MEM v0.7.17 & PathoScope v2.0: Lập bản đồ đoạn đọc và tái gán chính xác các đoạn đọc đa ánh xạ.
- pHMMER & MFOLD: Nhận diện miền protein bảo tồn và dự đoán cấu trúc vòng-kẹp (stem-loop) chứa mô-típ nonanucleotide tại vị trí khởi đầu sao chép (origin of replication).
- Thống kê: Kiểm định Chi-square ($\chi^2$), hồi quy tuyến tính (Linear Regression Models), phân tích thứ hạng Spearman ($\rho$), kiểm tra tính vững (robustness checks) loại trừ độ lệch khuếch đại PCR (PCR amplification bias).
Phát hiện đột phá và implications
Những phát hiện then chốt
Luận án ghi nhận 5 phát hiện mang tính đột phá về mặt sinh học và phương pháp luận:
-
Phát hiện và định danh 3 họ virus CRESS mới trên ký sinh trùng đường ruột người: Luận án giải mã thành công 20 chuỗi mã hóa CRESS virus hoàn chỉnh (trong đó có 18 hệ gen vòng trọn vẹn, mã đăng ký GenBank MT293410–MT293429). Phân tích dịch tễ học trên 374 mẫu phân người chứng minh sự hiện diện của virus liên kết tuyệt đối với nhiễm Entamoeba hoặc Giardia ($p < 0.001$, $\chi^2 = 36.0$). Cụ thể, 18/138 mẫu nhiễm Entamoeba dương tính với Naryaviridae hoặc Nenyaviridae (tỷ lệ hiện mắc 13%), và 3/11 mẫu nhiễm Giardia dương tính với Vilyaviridae (tỷ lệ hiện mắc 27%).
-
Bằng chứng tích hợp hệ gen virus hoàn chỉnh (EVEs) trong nhiễm sắc thể ký sinh trùng: Lần đầu tiên phát hiện các yếu tố virus nội sinh chứa đầy đủ cả hai gen Rep và Cap tích hợp trong hệ gen Entamoeba và Giardia. Đáng chú ý, một hệ gen virus trọn vẹn (isolate 84-AMS-03, MT293413.1) tích hợp chính xác trong contig dài 11.6 kb của Entamoeba dispar (AANV02000527.1) với độ bao phủ 100% và độ đồng nhất nucleotide đạt 84%. Trong Giardia duodenalis, một EVE dài tương tự được định vị trên contig 40.2 kb (GL50803_0007802) với độ bao phủ 99% và độ đồng nhất 73%.
-
Tính cố định tiến hóa và đáp ứng can thiệp RNA (RNA interference): Bằng chứng EVE xuất hiện đồng nhất trên các chủng phân lập từ các lục địa khác nhau qua nhiều thập kỷ: chủng E. histolytica KU27 (Nhật Bản, 2001), HM-3:IMSS (Mexico, 1972) và HM-1:IMSS (Mexico, 1967) đều bảo tồn tuyệt đối vị trí tích hợp gen virus (độ bao phủ 100%, độ đồng nhất 99.9%–100%). Dữ liệu giải trình tự small RNA gắn phức hợp Argonaute (AGO2-2) cho thấy các đỉnh đọc (coverage peaks) trùng khớp hoàn toàn với vị trí EVE, chứng minh cơ chế biểu sinh của ký sinh trùng đang chủ động bất hoạt phiên mã các gen virus cổ xưa này.
-
Hiện tượng tái tổ hợp mô-đun liên họ (Inter-family modular recombination): Phát hiện sự phân ly độc lập giữa gen Rep và gen Cap. Hai họ Naryaviridae và Nenyaviridae chia sẻ chéo hai nhóm vỏ capsid CCA1 (~467 aa) và CCA2 (~180 aa), tạo nên biến thiên chiều dài hệ gen lưỡng cực (bimodal genome size distribution). Ngược lại, họ Vilyaviridae chỉ sử dụng duy nhất vỏ CCA3, xác nhận rào cản tái tổ hợp sinh học giữa các loài virus có vật chủ khác nhau.
-
Hiệu lực của phương pháp Cluster-profiling trong việc phát hiện "Vật chất tối virus" (Viral dark matter): Phân tích mẫu phân F115 phát hiện 12% trong tổng số 16,160 đoạn đọc gom cụm thành 100 chuỗi đại diện không thể phân loại bằng BLAST thông thường. Lắp ráp de novo chuỗi này giải mã một hệ gen gokushovirus mới dài 5 kb (MK263179) với độ đồng nhất nucleotide chỉ đạt 72% so với dữ liệu tham chiếu gần nhất. Trên tập dữ liệu APPV ở lợn, mức độ gom cụm liên kết mạnh mẽ với tải lượng virus thực tế ($F(1,26) = 70.8, \text{Spearman's } \rho = 0.81, p < 0.001$) mà không bị sai lệch bởi hiệu ứng PCR bias ($\rho = 0.05, p = 0.79$).
Implications đa chiều
- Về mặt lý thuyết: Tái định nghĩa cây phát sinh chủng loại của giới Monodnaviria, khẳng định vai trò cầu nối tiến hóa của sinh vật đơn bào trong sự phát tán của virus DNA sang sinh vật bậc cao.
- Về mặt phương pháp luận: Cung cấp quy trình "Cluster-profiling" và "Mạng lưới tái tổ hợp mô-đun" như một giải pháp chuẩn hóa toàn cầu để giải mã vật chủ cho hàng triệu chuỗi metagenomic chưa được gán nhãn.
- Về ứng dụng y học và dược học: Entamoeba và Giardia gây ra hơn 300 triệu ca bệnh tiêu chảy trên toàn cầu mỗi năm (Kinsella et al., 2020). Việc phát hiện virus lây nhiễm ký sinh trùng mở ra hướng đi mới về cơ chế độc lực: virus có thể làm tăng độc lực (hypervirulence) gây phá hủy mô hoặc làm giảm độc lực (hypovirulence) mở đường cho liệu pháp vi sinh trị liệu (phage-like therapy cho ký sinh trùng).
Limitations và Future Research
Luận án thừa nhận một cách khách quan 4 hạn chế nghiên cứu:
- Giới hạn nuôi cấy in vitro: Chưa thể thiết lập dòng tế bào nuôi cấy thuần khiết axenic đồng thời cả ký sinh trùng và virus để quan sát động học chu kỳ nhân lên và hiệu ứng ly giải tế bào (cytopathic effect) theo thời gian thực.
- Đặc thù đoàn hệ nghiên cứu: Cỡ mẫu 374 đối tượng người có tới 93% là nam quan hệ tình dục đồng giới (MSM) và tỷ lệ lớn nhiễm HIV-1, dẫn đến tỷ lệ nhiễm Entamoeba (36.9%) và Giardia (2.94%) cao hơn quần thể dân cư nói chung, có thể tạo ra sai số chọn mẫu (selection bias).
- Độ nhạy phân tích cluster-profiling: Phương pháp nhận diện cụm đoạn đọc dựa trên enzyme cắt Mse1 chỉ phát huy hiệu quả cao với các mẫu có tải lượng virus lớn; đối với các virus có nồng độ thấp (như HIV-1 < 50 bản sao/$\mu\text{l}$), phương pháp vẫn phải dựa vào đối chiếu căn chỉnh protein.
- Dữ liệu âm tính tại Chương 6: Dự án tìm kiếm cressdnavirus trên các chủng nấm gây bệnh ở người không phát hiện được virus DNA sợi đơn mà chỉ thu được các dòng RNA mycoviruses mới.
Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo (Future Research Agenda):
- Phát triển hệ thống chuyển gen đảo ngược (reverse genetics) cho Naryaviridae và Vilyaviridae để thử nghiệm khả năng ức chế sinh trưởng của ký sinh trùng Entamoeba histolytica.
- Ứng dụng công nghệ giải trình tự đơn tế bào (single-cell viral metagenomics) nhằm cô lập chính xác từng tế bào ký sinh trùng mang hạt virus trong mẫu phân tươi.
- Mở rộng phân tích dịch tễ học trên các quần thể trẻ em suy dinh dưỡng và tiêu chảy cấp tại các quốc gia đang phát triển ở Châu Phi và Nam Á.
- Thử nghiệm các thuật toán học sâu (Deep Learning) tích hợp mô hình ngôn ngữ sinh học (Protein Language Models) dựa trên cấu trúc bậc ba dự đoán từ AlphaFold để nhận diện các vỏ capsid phân kỳ cao.
Tác động và ảnh hưởng
- Ảnh hưởng học thuật: Luận án đã đóng góp trực tiếp 3 bài báo trên các tạp chí khoa học hàng đầu thế giới gồm Nature Communications (2020), PNAS (2023), Virus Research (2019), Virus Evolution (2022) và Microbiology Spectrum (2022). Kết quả nghiên cứu đã được ICTV chính thức phê chuẩn đưa vào phân loại học virus quốc tế, dự kiến thu hút hàng trăm trích dẫn trong các lĩnh vực sinh học tiến hóa, vi sinh vật học và tin sinh học.
- Chuyển đổi y sinh và công nghiệp: Cung cấp công cụ phần mềm mã nguồn mở VIDISCA-e trên GitHub (
https://github.com/CormacKinsella/VIDISCA-e), hỗ trợ các trung tâm nghiên cứu bệnh truyền nhiễm toàn cầu tối ưu hóa chi phí giải trình tự virome với độ sâu thấp nhưng độ nhạy cao. - Tác động chính sách y tế công cộng: Cung cấp bằng chứng khoa học vững chắc giúp Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật (CDC) đánh giá lại các xét nghiệm chẩn đoán metagenomic, tránh việc chẩn đoán nhầm lẫn các đoạn gen virus ký sinh trùng là tác nhân virus gây bệnh mới trên người.
Đối tượng hưởng lợi
- Nghiên cứu sinh tiến sĩ (Doctoral Researchers): Tiếp cận một khung phương pháp luận hoàn chỉnh kết hợp giữa hóa sinh thư viện NGS và thuật toán tin sinh học để giải quyết bài toán "vật chất tối vi sinh".
- Các nhà khoa học cao cấp (Senior Academics): Nắm bắt mô hình tiến hóa mô-đun và cơ chế chuyển giao gen ngang (Horizontal Gene Transfer) giữa các giới sinh vật làm tiền đề cho các đề tài nghiên cứu cơ bản quy mô lớn.
- Bộ phận R&D công nghiệp dược & chẩn đoán: Khai thác các dòng mycovirus và protozoan virus làm vector trị liệu sinh học hoặc mục tiêu phát triển các kit chẩn đoán phân tử đa tác nhân.
- Nhà hoạch định chính sách y tế: Có căn cứ khoa học chính xác để xây dựng hướng dẫn an toàn sinh học và giám sát dịch tễ học các bệnh lây truyền qua đường tiêu hóa.
Câu hỏi chuyên sâu
1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?
Trả lời: Đóng góp độc đáo nhất là việc chứng minh sự tồn tại của hiện tượng trao đổi mô-đun tiến hóa quy mô lớn giữa các họ virus DNA sợi đơn thông qua mạng lưới tái tổ hợp mô-đun (Modular Recombination Networks), qua đó mở rộng Thuyết tiến hóa mô-đun của Botstein (1980). Luận án chứng minh hai họ virus hoàn toàn phân kỳ về protein sao chép Rep (Naryaviridae và Nenyaviridae) lại cùng chia sẻ chung các nhóm protein vỏ Cap (CCA1 và CCA2). Điều này khẳng định vỏ capsid và protein sao chép chịu áp lực chọn lọc độc lập, và ranh giới trao đổi di truyền được định hình bởi không gian tế bào vật chủ chung (Entamoeba) thay vì khoảng cách phát sinh loài của bộ gen.
2. Đổi mới phương pháp luận của nghiên cứu thể hiện như thế nào khi so sánh với các công trình trước đây?
Trả lời: So với các phương pháp dựa trên phân tích thành phần oligonucleotide (như chỉ số $d_2^*$ của Ahlgren et al., 2017) hoặc các mô hình máy học sâu (như VIDHOP của Mock et al., 2021) vốn chỉ hoạt động hiệu quả khi vật chủ đã có mặt trong tập dữ liệu huấn luyện, phương pháp của Kinsella là một quy trình phân tích độc lập hoàn toàn với dữ liệu huấn luyện (training-free). Bằng cách kết hợp: (1) gom cụm đoạn đọc sinh học từ enzyme cắt Mse1, (2) phân tích đối sánh EVEs trên contig thô của ký sinh trùng, và (3) thiết lập mạng lưới tái tổ hợp gen, phương pháp cho phép xác định vật chủ của các dòng virus phân kỳ cực xa mà các công cụ căn chỉnh truyền thống như BLAST hoàn toàn bỏ sót.
3. Phát hiện bất ngờ nhất trong dữ liệu thực nghiệm là gì?
Trả lời: Phát hiện bất ngờ nhất là sự hiện diện của một hệ gen virus CRESS hoàn chỉnh (MT293413.1) tích hợp nguyên vẹn vào contig của Entamoeba dispar và được bảo tồn cố định trên nhiều chủng Entamoeba histolytica phân lập cách nhau hơn 30 năm (từ 1967 đến 2001) trên các lục địa khác nhau (Mexico và Nhật Bản) với độ đồng nhất gần như tuyệt đối (99.9%–100%). Bất ngờ hơn, các phân tử small RNA gắn với protein Argonaute AGO2-2 của ký sinh trùng tạo ra các đỉnh ức chế chính xác tại vị trí gen virus này, chứng minh sự tồn tại của một hệ thống miễn dịch biểu sinh RNAi cổ xưa chống lại virus CRESS trên sinh vật đơn bào nhân thực.
4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập thực nghiệm (Replication Protocol) không?
Trả lời: Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ quy trình thực nghiệm và mã nguồn: quy trình ướt VIDISCA-NGS bao gồm nồng độ enzyme TURBO DNase, chu trình nhiệt PCR, loại màng lọc kích thước 1200 nm và 200 nm; danh mục toàn bộ các đoạn mồi phục vụ Inverse PCR và qPCR (báo cáo chi tiết trong Supplementary Table 10); mã nguồn pipeline xử lý dữ liệu và các tập lệnh phân tích tự động hóa được công khai trên kho lưu trữ GitHub chính thức (https://github.com/CormacKinsella/VIDISCA-e); toàn bộ dữ liệu giải trình tự thô được lưu trữ công khai tại European Nucleotide Archive (ENA) dưới mã truy cập PRJEB35571.
5. Kế hoạch nghiên cứu 10 năm được phác thảo như thế nào?
Trả lời: Kế hoạch 10 năm tập trung vào 4 trọng tâm: (1) Tái thiết lập tương tác vật chủ - virus trong điều kiện nuôi cấy axenic để đánh giá tác động của Naryaviridae lên độc lực gây loét của Entamoeba histolytica; (2) Khảo sát quy mô lớn sự phân bố của virus CRESS trên các loài ký sinh trùng khác như Trichomonas vaginalis, Leishmania và Trypanosoma; (3) Phát triển các thuật toán dự đoán cấu trúc không gian ba chiều của protein vỏ virus nhằm giải mã "vật chất tối" trong dữ liệu virome toàn cầu; (4) Khám phá tiềm năng ứng dụng mycovirus và protozoan virus làm công cụ chỉnh sửa gen hoặc liệu pháp sinh học ức chế ký sinh trùng kháng thuốc.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của Cormac M. Kinsella tạo nên những đóng góp học thuật mang tính bước ngoặt cho ngành vi sinh vật học và tin sinh học hiện đại:
- Định danh và phân loại chính thức 3 họ virus mới: Bổ sung họ Naryaviridae, Nenyaviridae và Vilyaviridae vào ngành Cressdnaviricota, mở rộng phạm vi vật chủ đã biết của virus DNA sợi đơn sang giới nguyên sinh động vật (Protozoa).
- Giải quyết bài toán "định danh vật chủ" (Host Identity Problem): Thiết lập khung phương pháp luận tính toán sinh học đa chiều (Cluster-profiling, Paleovirology EVEs, Modular Recombination Networks) giúp xác định vật chủ chính xác mà không cần dữ liệu huấn luyện máy học.
- Chứng minh nguồn gốc tiến hóa độc lập: Cung cấp bằng chứng phát sinh loài sáng tỏ cho thấy virus ssDNA lây nhiễm sinh vật đa bào đã tiến hóa độc lập ít nhất 3 lần từ các tổ tiên ký sinh trên sinh vật đơn bào.
- Khám phá cơ chế miễn dịch RNAi ở ký sinh trùng: Chỉ ra sự tương tác giữa các phân tử small RNA (AGO2-2) của Entamoeba trong việc kiểm soát và bất hoạt các yếu tố virus tích hợp nội sinh.
- Phát hiện dòng virus vertebrate-tropism cổ xưa: Chứng minh dòng CRESSV3 chuyển giao gen Rep cho avipoxviruses, xác lập họ Draupnirviridae lây nhiễm động vật bò sát/chim từ hơn 100 triệu năm trước.
- Mở ra 3 hướng nghiên cứu liên ngành mới: Mở đường cho nghiên cứu virome ký sinh trùng (Parasite Viromics), sinh học tiến hóa mô-đun virus (Modular Paleovirology) và ứng dụng vi sinh trị liệu nhắm vào các bệnh ký sinh trùng nguy hiểm trên phạm vi toàn cầu.
Trích đoạn nội dung luận án
Tải xuống để đọc toàn bộUvA-DARE (Digital Academic Repository) Computational discovery of viruses and their hosts Kinsella, C. Publication date 2023 Document Version Final published version Link to publication Citation for published version (APA): Kinsella, C. Computational discovery of viruses and their hosts. General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: https://uba.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible.
UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (https://dare.nl) Download date:31 Aug 2023 Computational discovery of viruses and their hosts ? x Cormac M. Kinsella Computational discovery of viruses and their hosts Cormac M. Kinsella ISBN: 978-94-6483-273-0 © 2023 Cormac M. Kinsella Layout and cover design: Cormac M.
Kinsella Chapter facing art: Kristel Parv Kinsella, inspired by the works of J. Tolkien Printing: Ridderprint, the Netherlands The research reported in this doctoral thesis received financial assistance from the European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme, under the Marie Skłodowska-Curie Actions grant agreement no. Financial support for the printing of this thesis was kindly provided by the Amsterdam UMC. Computational discovery of viruses and their hosts ACADEMISCH PROEFSCHRIFT ter verkrijging van de graad van doctor aan de Universiteit van Amsterdam op gezag van de Rector Magnificus prof.
Verbeek ten overstaan van een door het College voor Promoties ingestelde commissie, in het openbaar te verdedigen in de Agnietenkapel op maandag 11 september 2023, te 14.00 uur door Cormac Michael Kinsella geboren te Harrow Promotiecommissie Promotor: dr. van der Hoek AMC-UvA Copromotores: prof. Berkhout AMC-UvA dr. Bart Tergooi Ziekenhuis Overige leden: prof.
de Jong AMC-UvA prof. Russell AMC-UvA prof. Koopmans Erasmus Universiteit Rotterdam dr. Krupovic Institut Pasteur dr.
Matthijnssens KU Leuven Faculteit der Geneeskunde Table of contents Chapter 1 General introduction and scope of this thesis 7 2 Enhanced bioinformatic profiling of VIDISCA libraries 19 for virus detection and discovery (Virus Research, 2019) 3 Entamoeba and Giardia parasites implicated as hosts of 33 CRESS viruses (Nature Communications, 2020) 4 Host prediction for disease-associated gastrointestinal 57 cressdnaviruses (Virus Evolution, 2022) 5 Vertebrate-tropism of a cressdnavirus lineage implicated 85 by poxvirus gene capture (PNAS, 2023) 6 Human clinical isolates of pathogenic fungi are host to 115 diverse mycoviruses (Microbiology Spectrum, 2022) 7 General discussion 135 Addendum Summary 146 Samenvatting 148 Author affiliations 150 Author contributions 152 About the author 153 PhD portfolio 154 List of publications 158 Acknowledgements 161 Chapter 1 General introduction and scope of this thesis Chapter 1 The discovery of viruses, a distinct class of disease agents ‘Virus’, derived from a Latin word meaning poison, has been used to non-specifically describe infectious disease agents for centuries1. When scientists in the 1800s came to understand that some microbes could cause disease, a flurry of cellular pathogens were isolated in pure culture by growing them on nutrient-rich matrices, allowing their associations to disease to be directly tested under experimental conditions2. An assumption that culturable bacteria, fungi, and protists caused all infectious diseases took root. Usage of the term ‘virus’ remained non-specific into the early 1900s, with apparent oxymorons such as ‘bacterial viruses’ appearing3 – meaning ‘bacterial agents of disease’ – not ‘viruses infecting bacteria’ as we might now understand it.
However, in 1898 a key conceptual leap was made that would shape the modern conception of viruses, namely that a category of disease agents distinct from bacteria existed. First, work by Friedrich Loeffler and Paul Frosch showed that the causative agent of foot and mouth disease could pass through filters capable of holding back all known bacterial cells4. They postulated a very small, particulate agent of disease that was capable of replication (i. Secondly, Dutch microbiologist Martinus Beijerinck showed that the agent causing tobacco mosaic disease could also pass filters5.
Beijerinck proposed a non-bacterial identity for the agent, though he considered it to be liquid-like, or as he called it: “contagious living fluid”. A new class of agents known as ‘filterable viruses’ were thus recognised, and over the following decades non-specific usage of the terminology faded, until ‘filterable’ was also eventually dropped. What defines a virus? We now understand that viruses are not liquid-like, instead they are made up of infectious particles called virions. The small size of most virions explains why they can pass fine filters, though size does not define them.
In fact, so-called ‘giant viruses’ have been found that are larger than the smallest bacteria6,7. More fundamentally, viruses are acellular but require cells to replicate, as they lack some of the necessary machinery for producing further generations. They are thus obligate intracellular parasites of host replication machinery, and must transmit between host cells to gain access to this. Virions represent individual virus units, such that in some cases a single virion can produce a new infection.
At the least, virions possess a genome or genome segment of RNA or DNA, and some proteins encoded by that genome. While these features define most known viruses, biological discoveries regularly complicate attempts at an all-encompassing yet restrictive definition. For example, one definition8 splits biological entities into either ribosome- encoding or capsid-encoding forms, i., cellular life and viruses respectively. However, viruses that lack capsids and encode other proteins are now known9, excluding them from this definition, and also from the viroids (virus-like elements that do not encode protein).
Dropping the capsid requirement of the definition opens the door to other selfish genetic elements usually considered distinct from viruses, such as some transposons or plasmids. A clean definition is likely elusive, and given that viruses are a polyphyletic group (i., they did not all evolve from a single common ancestor) this should be expected. Individual 8 General introduction and scope of this thesis discoveries should therefore be evaluated in terms of how much their genetic relationships and biological behaviours overlap with those considered typically viral. The development of virus discovery techniques The visible effects of viruses have long been readily apparent to humans10,11, likely since our origin12.
Experimentation with viruses also began before their nature was understood, for example Edward Jenner’s work on smallpox vaccination in the 1700s 13. Virus discovery as a field arguably began with Loeffler, Frosch, and Beijerinck’s conclusions regarding filterable viruses4,5. By 1912, application of filtration techniques resulted in the discovery of at least 17 distinct viruses14,15, though detection and study was only possible via the diseases they induced. The subsequent development of virus discovery was tied to technological innovations enabling deeper characterisation and thus categorisation of filterable agents.
Key early advances were the 1935 crystallisation of tobacco mosaic virus (TMV)16, the 1937 discovery of viral nucleic acids17, the 1939 electron microscope analysis of TMV18, and the 1941 application of X-ray crystallography techniques19. These enabled analysis of virus biochemistry and morphology. Viruses only replicate in host cells, so early attempts to produce pure virus cultures in nutrient media were unsuccessful. Early propagation was done in whole organisms or eggs, and this had multiple drawbacks including bacterial contamination of stocks20.
It was during a negative experiment aiming to grow pure vaccinia virus that Frederick Twort inadvertently established the first virus culture, though it was not vaccinia. Reporting in 191521, Twort noticed that colonies of growing bacterial contaminants were killed off by a filterable, dilutable, infectious agent that could be propagated between colonies. Subsequent work from 1917 by Félix d'Hérelle named the ‘bacteriophages’ and properly established virus culture in bacterial cells, and specifically the plaque assay, as vital tools in virus research and discovery22. As eukaryotic tissue and cell culture techniques developed later in the 1900s, many viruses were discovered by inoculating cultures with infectious material and isolating agents23–25.
Cell, tissue, or host tropism could also be tested using panels of different cell cultures25, something that Twort already comprehended in 1915 when testing bacteriophage host tropism21. With advances in immunology, the possibility to characterise isolated viruses by their antigenic or serological properties also developed26, and with this came the ability to test for viruses using immunoassays25,27. While two agents may share similar morphology and cytopathic effects, different responses to antibodies could distinguish ‘serotypes’. By the 1970s scientists already had powerful tools to find and characterise new pathogenic viruses, but a revolution in molecular biology was underway.
Restriction enzymes that cut DNA in specific locations had been isolated28, vital components of molecular cloning techniques that enabled amplification of specific nucleic acids29. In 1977 Frederick Sanger refined a technique for DNA sequencing and the first ever virus genome sequence was published, φX17430,31. This would eventually allow determination of comparative virus 9 Chapter 1 relationships, but did not immediately overhaul virus discovery methods, as it required pure input DNA at high copy number, and was therefore limited to viruses established in culture or cloned fragments. In the 1980s the polymerase chain reaction (PCR) method was developed32,33, which enabled amplification of specific DNA sequences via multiple cycles of in vitro reactions.
Because PCR utilises ‘primer’ sequences that match sections of a target, it could also be used to detect closely related targets34. Primers designed to target sequences highly conserved across an entire viral lineage have often been used to detect unknown members of the group35. However, detection range is limited by design, and more divergent viruses will not be found. To solve this, advanced molecular biology techniques agnostic to virus sequence were applied.
These included shotgun cloning, wherein total DNA from a sample was randomly sheared, and fragments were then cloned and Sanger sequenced 36,37. As this could be applied to mixed samples containing nucleic acids from multiple organisms, it became known as ‘metagenomics’37. Representational difference analysis was another approach38, which disproportionately amplified nucleic acids found in one sample but not another (i., a virus found in a test sample, but not in a control sample). Similarly, techniques such as sequence-independent single primer amplification (SISPA) and virus discovery based on cDNA-amplified fragment length polymorphism (VIDISCA) used restriction enzymes to digest nucleic acids in control and test samples before amplification, with different nucleic acid fragments then visualised by gel electrophoresis39,40.
Samples containing a new virus displayed unique nucleic acid fragments, which were then excised from the gel, cloned, and sequenced. Inclusion of a reverse transcription step converting RNA virus genomes to DNA enabled detection of either genome type, and further laboratory techniques could non- specifically enrich virus nucleic acids relative to background. These included centrifugation of samples to remove heavier cell debris, filtration of supernatants to remove other large particles, treatment with nucleases such as DNase to digest naked host chromosomal DNA, and use of selective primers during reverse transcription to reduce host ribosomal RNA levels39–42. Virus discovery with high-throughput sequencing Despite the maturation of virology during the 1900s, key issues remained at the turn of the millennium.
One of these, discussed by Twort even in 1915 21, was efficient identification of viruses that do not cause visible disease or cytopathic effect, and relatedly, how to find viruses infecting host species difficult to isolate in cell culture. While molecular techniques offered promising solutions, they remained low-throughput and logistically complex36,38–40. It would be the development of high-throughput sequencing (HTS) platforms in the 2000s43 that precipitated a major leap forward for virus discovery. Also known as massively parallel sequencing or next-generation sequencing, HTS techniques allow simultaneous sequencing of millions of DNA fragments in a processed sample known as a ‘library’.
As the fragments overlap in their sequence content, they can be computationally ‘assembled’ together into longer sequences44, including whole virus genomes.
Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ
Trích dẫn luận án này
Cormac M. Kinsella (2023). Computational discovery of viruses and their hosts [Luận án tiến sĩ, University of Amsterdam]. LuanAn.net. https://luanan.net/sinh-hoc/vi-sinh-vat-hoc/computational-discovery-of-viruses-and-their-hosts
Câu hỏi thường gặp
Luận án "Computational discovery of viruses and their hosts" nghiên cứu về vấn đề gì?
Computational discovery of viruses and their hosts using bioinformatics and machine learning techniques.
Luận án "Computational discovery of viruses and their hosts" được bảo vệ tại trường nào?
Luận án này được bảo vệ tại University of Amsterdam. Năm bảo vệ: 2023.
Luận án "Computational discovery of viruses and their hosts" thuộc chuyên ngành gì?
Luận án "Computational discovery of viruses and their hosts" thuộc chuyên ngành Tin sinh học và Virus học. Danh mục: Vi Sinh Vật Học.
Luận án "Computational discovery of viruses and their hosts" có bao nhiêu trang?
Luận án "Computational discovery of viruses and their hosts" có 167 trang. Bạn có thể xem trước một phần tài liệu ngay trên trang web trước khi tải về.
Cách tải luận án "Computational discovery of viruses and their hosts" về máy như thế nào?
Để tải luận án về máy, bạn nhấn nút "Tải xuống ngay" trên trang này, sau đó hoàn tất thanh toán phí lưu trữ. File sẽ được tải xuống ngay sau khi thanh toán thành công. Hỗ trợ qua Zalo: 0559 297 239.