Luận án Tiến sĩ: Đa dạng di truyền địa lan Cymbidium ở miền núi Đông Bắc - Phạm Phương Thu (2023)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM PHƯƠNG THU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN ĐỊA LAN (CYMBIDIUM) KHU VỰC MIỀN NÚI ĐÔNG BẮC VIỆT NAM PHỤC VỤ CÔNG TÁC BẢO TỒN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIIỆP HÀ NỘI, 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM PHƯƠNG THU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN ĐỊA LAN (CYMBIDIUM) KHU VỰC MIỀN NÚI ĐÔNG BẮC VIỆT NAM PHỤC VỤ CÔNG TÁC BẢO TỒN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG Chuyên ngành : Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số : 9620111 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. Ngô Xuân Bình 2. Trần Ngọc Hùng HÀ NỘI, 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả Phạm Phương Thu ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban Giám đốc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, các thầy cô giáo Ban Thông tin và Đào tạo, cũng như cán bộ của các Ban trong VAAS luôn động viên, tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS. Ngô Xuân Bình và TS.Trần Ngọc Hùng, những người thầy tâm huyết đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hướng cho tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Thạc sĩ Nguyễn Thị Tình, các bạn bè đồng nghiệp khoa Công Nghệ Sinh Học & Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên và viện Nghiên cứu Rau quả đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi tiến hành nghiên cứu cũng như chia sẻ những kinh nghiệm để hoàn thành bản luận án.

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới đồng nghiệp của tôi, các cán bộ đang công tác tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn tới gia đình của tôi là nguồn động viên và truyền nhiệt huyết để tôi hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày….năm 2023 Nghiên cứu sinh Phạm Phương Thu iii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục.

iii Danh mục các chữ viết tắt. vi Danh mục bảng. ix Danh mục hình. xi MỞ ĐẦU.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của luận án. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Ý nghĩa khoa học.

Ý nghĩa thực tiễn. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu.

Những đóng góp mới của luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI. Giới thiệu chung về hoa lan. Đặc điểm thực vật học, phân loại và phân bố của chi lan kiếm.

Nguồn gen lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam. Giá trị, thực trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen lan kiếm. Tình hình nghiên cứu chi lan kiếm trên thế giới và Việt Nam. Nghiên cứu đa dạng di truyền chi lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam.

Nghiên cứu nhân giống và lai tạo chi lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam. Các kết luận qua phân tích tổng quan .37 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phương đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái. Kỹ thuật sinh học phân tử.

Phương pháp lai tạo giống nguồn gen lan kiếm. Phương pháp nhân giống in vitro. Phần mềm xử lý số liệu. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.57 CHƯƠNG III.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị hình thái. Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị phân tử. Kết quả PCR các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu.

Kết quả giải trình tự vùng lục lạp mẫu giống lan kiếm nghiên cứu. Kết quả nhận biết các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu. Kết quả xác định các chỉ thị phân tử đặc trưng để nhận dạng các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu. So sánh, phân tích mối tương quan giữa tập đoàn lan kiếm nghiên cứu ở cây đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử.

Đề xuất các hướng nghiên cứu, sử dụng nguồn gen lan kiếm hiện có. Nghiên cứu nhân giống một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng phương pháp nhân giống in vitro. Kết quả nhân giống in vitro loài lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (Cymbidium wenshanense). Kết quả nhân giống in vitro loài địa lan Bạch ngọc (Cymbidium mastersii).

Nghiên cứu lai, tạo vật liệu khởi đầu từ một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc. Khả năng đậu quả của một số tổ hợp lai lan kiếm có nguồn gốc từ vùng núi Đông Bắc Việt Nam. Khảo sát và xác định xác định marker nhận dạng con lai F1 ở giai đoạn sớm bằng chỉ thị phân tử SSR .130 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .136 Danh mục các công trình khoa học công bố liên quan đến luận án tiến sĩ .138 Tài liệu tham khảo .154 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Diễn giải A Adenine ABI Applied Biosystems Incorporated Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài AFLP đoạn nhân bản) atpβ gene ATP synthase beta - subunit gene BA Benzyladenine Basic Local Alignment Search Tool (Công cụ tìm kiếm sắp gióng BLAST cột từng phần cơ bản) Bp Base pairs (Cặp bazơ) C Cytosine cpDNA Chloroplast DNA (DNA lục lạp); CT Công thức CTAB Cetyltrimethylammonium bromide (Dung dịch đệm) CTTN Công thức thí nghiệm CV Coefficient of Variation (Hệ số biến động) Cym Cymbidium D Dendrobium Đ/c Đối chứng DL Địa lan DNA Deoxyribonucleic acid (Axít Deoxyribonucleic) DNAse Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediamine tetraacetate EtBr Ethidium bromide G Guanin vii GA3 Gibberellin (Hormone sinh trưởng thực vật) IAA Indole - 3 - acetic acid (Hormone sinh trưởng thực vật) IBA Indole - 3 - butyric acid (Hormone sinh trưởng thực vật) ISSR Inter - Simple Sequence Repeat (Đoạn lặp trình tự đơn) ITS Internal transcribed spacer IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry Ln Likelihood LSD Least Significant Difference Test matK Maturase K (Gen maturase K Molecular Evolution Genetics Analysis (Phân tích di truyền tiến MEGA hóa phân tử) ML Maximum Likelihood mtDNA Mitochondrial DNA National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông NCBI tin Công nghệ sinh học Quốc gia) ndhF NADH dehydrogenase subunit F nDNA Nuclear DNA ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reaction ( Phản ứng chuỗi Polymerase) PIC Polymorphism Information Content ( Hệ số Thông tin đa hình) PLBs Protocorm like Bodies QTLs Quantitative trait locus Random Amplified Polymorphic DNAs (DNA đa hình nhân ngẫu RAPD nhiên rbcL Ribulose - bisphosphate carboxylase RCB Randomized Completely Block (Khối Ngẫu nhiên đủ) rDNA Ribosomal DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình về chiều dài viii của các đoạn DNA) RNA Ribonucleic acid RNAse Ribonuclease SCARs Sequence - Characterized Amplified Region Sect Section SSR Simple Sequence Repeats (Trình tự lặp lại đơn giản) T Thymine Taq Thermus aquaticus TBE Tris/Borate/EDTA THT Than hoạt tính Tm Melting Temperature UV Ultraviolet V Voltex α NAA α - Naphthalene acetic acid (Hormone sinh trưởng thực vật) ΣDNA DNA tổng số ix DANH MỤC BẢNG TT Nội dung bảng Trang 2. Các mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam được sử dụng trong nghiên cứu.

Các cặp mồi được sử dụng trong các phản ứng PCR. Bảng đánh giá một số đặc điểm hình thái theo quy phạm khảo nghiệm DUS cho lan kiếm của UPOV. Bảng mã hoá theo ma trận các tính trạng hình thái của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm. Tỉ lệ phần trăm thành phần nucleotide của 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu và các mẫu tham chiếu.

Hệ số tương đồng di truyền về trình tự nucleotide giữa 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu. Hệ số tương đồng di truyền về trình tự nucleotide giữa 24 mẫu giống lan kiếm với các mẫu tham chiếu. Một số vị trí sai khác về trình tự nucleotide của các mẫu giống nghiên cứu và mẫu tham chiếu. So sánh phân nhóm dựa vào hình thái và chỉ thị phân tử của 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu.

So sánh ảnh hưởng của bốn môi trường nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của hạt lan kiếm Bạch ngọc đuôi công. So sánh ảnh hưởng của cytokinin (Kinetin, TDZ, BA) đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA, IAA) đến khả năng tái sinh rễ lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần).

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng tái sinh rễ của chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của 3 loại auxin (IBA, NAA, IAA) đến khả năng tái sinh rễ của cây l an kiếm Bạch ngọc. Ảnh hưởng của NAA kết hợp THT đến khả năng nhân nhanh rễ lan kiếm Bạch ngọc trong điều kiện in vitro (sau 10 tuần). Ảnh hưởng của nhóm cytokinins (Kinetin; TDZ, BA) đến khả năng tái sinh chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc (sau 8 tuần).

Ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng tạo chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc trong điều kiện in vitro (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng tạo cây con lan kiếm Bạch ngọc từ rễ trong điều kiện in vitro ( sau 8 tuần). Một số đặc điểm hình thái hoa, lá của các mẫu giống dùng làm bố, mẹ tạo quần thể lai F1. Tỷ lệ đậu quả của một số tổ hợp lai lan kiếm vùng núi Đông Bắc .125 xi DANH MỤC HÌNH TT Nội dung hình Trang 3.

Mặt hoa 24 mẫu giống lan kiếm thu thập tại vùng núi Đông Bắc. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 24 mẫu giống lan kiếm dựa trên chỉ thị hình thái. Kết quả PCR 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu với cặp mồi rbcL - F/rbcL - R; M: Marker 100bp ladder. Sơ đồ hình cây của 24 mẫu giống lan kiếm và các mẫu giống tham chiếu .