Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm panax sp phân bố

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM __________________ LÊ NGỌC TRIỆU NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ TỰ NHIÊN TẠI LÂM ĐỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP ĐÀ LẠT, 2017 A BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM __________________ LÊ NGỌC TRIỆU NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ TỰ NHIÊN TẠI LÂM ĐỒNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. NGUYỄN VĂN KẾT GS. TRẦN DUY QUÝ ĐÀ LẠT, 2017 B LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng để bảo vệ ở bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Đà Lạt, ngày 21 tháng 12 năm 2017 Tác giả luận án Lê Ngọc Triệu i LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành luận án, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. Nguyễn Văn Kết, GS. Trần Duy Quý, những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ tận tình để tôi có thể tôi hoàn thành luận án. Xin đƣợc trân trọng cám ơn quý thầy cô thuộc Ban đào tạo sau đại học -Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam, Viện Di truyền Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Đà Lạt đã truyền đạt các kiến thức, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, sinh hoạt chuyên môn và thực hiện luận án.

Để có đƣợc các kết quả nghiên cứu trong luận án này, tôi xin chân thành cám ơn Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia và đặc biệt là TS. Trần Văn Tiến đã tạo điều kiện cho tôi tham gia, thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền chi sâm (Panax L. Xin đƣợc tri ân đến Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên cũng nhƣ các anh em, bạn bè đồng nghiệp gần xa,….đã chia sẻ, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Sau cùng, từ tận đáy lòng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến cha mẹ tôi, ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng tôi nên ngƣời và vợ tôi đã luôn động viên và chia sẻ để tôi phấn đấu hoàn thành luận án này.

Lê Ngọc Triệu ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan. ii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng. vii Danh mục hình.

ix MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.

Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài. Những đóng góp mới của luận án .TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Vai trò của các loại sâm trong đời sống. Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu về phân loại, khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại các taxon và đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật.

Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật. Các phƣơng pháp dựa trên đặc điểm hình thái. Các phƣơng pháp dựa trên chỉ thị phân tử. Các phƣơng pháp dựa trên chỉ thị phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật.

Các phƣơng pháp xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại. Cơ sở khoa học của việc sử dụng các trình tự DNA bảo thủ cao trong phân tích quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật. Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền quần thể. Vị trí hệ thống học và phân loại chi Panax, họ Araliaceae.

Các nghiên cứu trên thế giới. Các nghiên cứu tại Việt Nam. Quan hê ̣ phát sinh chi Panax L. dƣ̣a trên hê ̣ thố ng ho ̣c mƣ́c đô ̣ phân tƣ̉.

Các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon trong chi Panax không dựa vào giải trình tự DNA. Các nghiên cứu trên thế giới. Các nghiên cứu tại Việt Nam. Các nghiên cứu dựa trên giải trình tự các vùng DNA bảo thủ.

Các nghiên cứu trên thế giới. Các nghiên cứu tại Việt Nam. Các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon trong chi Panax sử dụng DNA fingerprint từ các vùng DNA bảo thủ. Các nghiên cứu đánh giá đa da ̣ng di truyề n quần thể ở chi Panax.

Nghiên cứu về thành phần hoạt chất ở chi Panax. Nhận xét chung. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu.

Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại của sâm Lang Bian và các taxon Panax khác. Vật liệu cho nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể sâm Lang Bian. Vật liệu cho nghiên cứu sơ bộ thành phần saponin của sâm Lang Bian. Nội dung nghiên cứu.

Phƣơng pháp nghiên cứu .Điều tra, thu thập mẫu. Thu thập, xử lý mẫu để nghiên cứu hình thái thực vật học, lƣu trữ và nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại. Thu thập mẫu nhằm nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể. Thu thập mẫu nhằm nghiên cứu sơ bộ về thành phần saponin.

Nghiên cứu về hình thái nhằm bổ sung dữ liệu cho xác định vị trí phân loại sâm Lang Bian. Tách chiết DNA và kiểm tra chất lƣợng, hàm lƣợng DNA trong các mẫu. Phân loại, phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự bảo thủ. Phân lập và khuếch đại các vùng DNA bảo thủ.

Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự DNA bảo thủ cao. Phân tích đa dạng và biến động di truyền trong quần thể dựa trên DNA fingerprint nảy sinh bằng kỹ thuật ISSR. Sử dụng kỹ thuâ ̣t ISSR để hình thành các DN A fingerprint. Phân tích đa dạng và biến động di truyền dựa trên các DNA fingerprint thu nhận đƣợc.

Sơ bộ phân tích, so sánh thành phần saponin. 59 iv Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. Vị trí phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và một số loài khác cùng chi dựa trên đặc điểm hình thái và trình tự DNA bảo thủ.

Vị trí phân loại thực vật của sâm Lang Bian dựa trên đặc điểm hình thái. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa trên các trình tự bảo thủ. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa trên vùng gene matK. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa trên vùng trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2.

Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi khác dựa trên trình tự vùng gene 18S rRNA. Khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại dựa vào việc phối hợp các vùng trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK. Vị trí phân loại của sâm Lang Bian dựa trên quan hệ phát sinh chủng loại với các taxon Panax khác ở mức độ phân tử và đặc điểm hình thái. Đánh giá đa dạng di truyền ở quần thể sâm Lang Bian.

Kết quả thu thập, chuẩn bị mẫu và chọn lọc mồi phục vụ cho đánh giá đa dạng di truyền quần thể. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần thể LD. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần thể DR. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền tổng thể taxon nghiên cứu.

Kết quả nghiên cứu về phân tích, so sánh sơ bộ thành phần saponin ở sâm Lang Bian và một số taxon cùng chi khác. 129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 132 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 134 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

135 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: PHỔ ĐỒ TRÌNH TỰ CÁC VÙNG DNA BẢO TỒN CỦA CÁC TAXON ĐƢỢC THU THẬP TRONG NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC 2: SO SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG BẢO TỒN GIỮA CÁC TAXON KHẢO SÁT PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ ĐIỆN DI DNA KHUẾCH ĐẠI BẰNG CÁC MỒI ISSR v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence DDBJ: DNA Data Bank of Janan DR: Đam Rông G-Rb1: Ginsenoside Rb1 G-Rd: Ginsenoside Rd G-Re: Ginsenoside Re G-Rg1: Ginsenoside Rg1 He: expected heterozygosity ISSR: Inter Simple Sequence Repeats ITS: Internal transcribed spacer IUCN: International Union for Conservation of Nature LD: Lạc Dƣơng M-R2: Majonoside R2 NCBI: National Centre for Biotechnology Information N-R1: Notoginsenosid R1 PPB: percentage of polymorphic bands PS: Panax stipuleanatus (lá chét nguyên) PSDL: Panax stipuleanatus (lá chét xẻ) PV: Panax vietnamensis PVF: Panax vietnamensis var. fuscidiscus PVL: Panax vietnamensis var. langbianensis RAPD: Random Amplified Polymorphic RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism rRNA: ribosomal RNA SCAR: Sequence Characterized Amplified Region SNP: Single Nucleotide Polymorphism SSR: Simple sequence Repeat - Microsatellites VNTR: Variable Number of Tandem Repeats - Minisatellites vi DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 1. Đặc điểm hình thái tƣơng đồng và khác biệt giữa chi Aralia và chi Panax.

Phân loại các taxon Panax ở châu Á theo quan điểm của các nhà nghiên cứu hệ thống học thực vật giai đoạn 1970-1975. Phân loại các taxon Panax ở châu Á theo quan điểm của các nhà nghiên cứu hệ thống học thực vật giai đoạn 1996-2014. Số lƣợng nhiễm sắc thể theo Yang (1981). Các mẫu sử dụng để tách chiết DNA cho phân tích quan hệ phát sinh chủng loại.

Mã truy cập các trình tự 18S rRNA; vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 và một phần gene matK của các mẫu thu thập tại Việt Nam sử dụng trong nghiên cứu phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại. Các trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8SrRNA-ITS2 và gen matK đƣợc lấy từ Genbank sử dụng trong nghiên cứu phân tích quan hệ phát sinh chủng loại. So sánh đặc điểm hình thái giữa sâm Lang Bian, P. Thành phần và số lƣợng nucleotide các trình tự một phần gene matK ở các taxon đƣợc khảo sát.

Những vị trí khác biệt ở trình tự một phần gene matK của đối tƣợng nghiên cứu so với các taxon khác cùng chi. Khoảng cách di truyền giữa các taxon đƣợc khảo sát dựa trên trình tự một phần vùng gene matK. Sự khác biệt giữa trình tự gene matK giữa Panax sp. So sánh trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 giữa các mẫu thuộc taxon Panax vietnamensis từ các nguồn khác nhau.

Thành phần, số lƣợng nucleotide các trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 khảo sát .