Nghiên cứu tinh sạch, tính chất và ứng dụng Acetylcholinesterase từ ốc bươu vàng - Luận án TS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- LÊ MINH TRÍ NGHIÊN CỨU TINH SẠCH, TÍNH CHẤT ĐẶC TRƯNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA ACETYLCHOLINESTERASE TỪ ỐC BƯƠU VÀNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC H À NỘI, 2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------- LÊ MINH TRÍ NGHIÊN CỨU TINH SẠCH, TÍNH CHẤT ĐẶC TRƯNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA ACETYLCHOLINESTERASE TỪ ỐC BƯƠU VÀNG Chuyên ngành : Hoá sinh học Mã số : 62.15 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. NGUYỄN QUỐC KHANG 2. BÙI PHƯƠNG THUẬN H À NỘI, 2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.

Tác hại và lợi ích của ốc bươu vàng 4 1. Tác hại của ốc bươu vàng 4 1. Lợi ích của ốc bươu vàng 5 1. Các biện pháp diệt ốc bươu vàng 6 1.

Các biện pháp diệt ốc bươu vàng ở Việt Nam 6 1. Giới thiệu chung về Acetylcholinesterase (AChE) 7 1. Cấu trúc trung tâm hoạt động của AChE 9 1. Vai trò của AChE trong hoạt động thần kinh 14 1.

Cơ chế ức chế AChE 16 1. Nghiên cứu khả năng sử dụng AChE để phát hiện thuốc trừ sâu 21 1. Ứng dụng của AChE 21 1. Chất ức chế AChE 22 1.

Chất ức chế AChE từ thiên nhiên 22 1. Các chất ức chế tổng hợp hóa học 23 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Các chất độc hóa học dùng trong chiến tranh 23 1. Thuốc bảo vệ thực vật 24 CHƢƠNG 2.

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2. Đối tƣợng nghiên cứu 30 2. Phƣơng pháp 30 2. Định lượng protein 30 2.

Tách chiết enzyme 30 2. Tinh sạch enzyme 31 2. Kiểm tra độ sạch của AChE bằng điện di biến tính trên gel 32 polyacrylamide (SDS - PAGE) 2. Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme AChE 33 2.

Phương pháp cố định AChE trên màng polymer đồng trùng hợp 35 2. Phương pháp kế hoạch hoá thực nghiệm và xử lý số liệu 35 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3. Khảo sát hàm lƣợng AChE của một số đối tƣợng nghiên cứu 37 3.2 Kết quả khảo sát đặc điểm sinh học của ốc bƣơu vàng 39 3.

Kích thước vỏ và tỉ lệ giới tính 39 3. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường tới các đặc điểm sinh thái của 40 ốc bươu vàng 3. Ảnh hưởng của bùn tới khả năng đẻ trứng của ốc bươu vàng 40 3. Ảnh hưởng của độ sâu lớp nước đến khả năng đẻ trứng và tỉ lệ chết 41 của ốc bươu vàng TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.

Hàm lượng AChE của ốc bươu vàng qua các thời kỳ trong năm 43 3. Lựa chọn nguồn tách chiết và tinh sạch AChE 46 3.3 Tách chiết, nghiên cứu tính chất của AChE từ ốc bƣơu vàng 47 3. Tinh sạch AChE bằng sắc ký trao đổi ion 49 3. Kiểm tra độ sạch và xác định KLPT của AChE bằng phương pháp 50 điện di trên Gel SDS-PAGE 3.

Quy trình tách chiết và tinh sạch AChE 51 3. Xác định khối lượng phân tử của AChE từ ốc bươu vàng 54 3. Xác định khối lượng phân tử của AChE bằng phương pháp HPLC 54 3. Xác định hoạt độ thuỷ phân acetylcholin của chế phẩm AChE từ ốc 56 bươu vàng 3.

Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến hoạt độ AChE từ ốc 57 bƣơu vàng 3. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ AChE 57 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ AChE 59 3. Sự biến đổi hoạt độ AChE theo thời gian 61 3.

Ảnh hưởng của một số ion kim loại và gốc phospho peroxide (P2O5) 62 đến hoạt độ AChE. Ảnh hƣởng của một số chế phẩm trừ sâu đến hoạt độ AChE từ ốc 64 bƣơu vàng 3. Ảnh hưởng của một số chế phẩm thảo mộc diệt ốc bươu vàng đến 65 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com hoạt độ AChE 3. Ảnh hưởng của flavonoid tổng số chiết từ một số cây thuốc đến 66 hoạt độ AChE 3.

Ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ sâu đến hoạt độ AChE từ ốc 67 bươu vàng 3. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Ofatox (Dipterex, Dylox) đến hoạt 68 độ AChE 3. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Secsaigon đến hoạt độ AChE 70 3. Ảnh hưởng của thuốc diệt ốc bươu vàng Dioto 250EC đến hoạt độ 72 AChE 3.

Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Topsin đến hoạt độ AChE 73 3. Nghiên cứu động học ức chế của AChE 74 3. Các thông số động học đặc trưng VM, KM của AChE 74 3. Nghiên cứu ảnh hưởng ức chế của flavonoid từ các cây thuốc 76 khác nhau 3.

Nghiên cứu ảnh hưởng ức chế của flavonoid chiết từ cây Bạch 77 đồng nữ 3. Xây dựng phƣơng pháp phát hiện HCBVTV trên cơ sở sử dụng 81 AChE 3. Nghiên cứu, ứng dụng AChE tinh sạch phát hiện một số loại thuốc 81 trừ sâu phospho hữu cơ 3. Nghiên cứu cố định AChE trên màng polymer đồng trùng hợp 86 KẾT LUẬN 87 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐỀ NGHỊ 88 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN 89 QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO 90 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỞ ĐẦU Ốc bươu vàng là loài sinh vật được du nhập vào nước ta từ những năm 80 của thế kỷ trước và hiện nay đã sinh sôi trên diện rộng gây hại cho cây trồng, hoa màu; đặc biệt là cây lúa.

Ốc bươu vàng có nguồn gốc từ Trung và Nam Mỹ nhưng thích ứng rất nhanh với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm của Việt Nam. Ốc bươu vàng có mặt ở khắp nơi: đồng ruộng, kênh mương, ao hồ,…. Vì thức ăn chủ yếu là lá lúa nên ốc bươu vàng đã trở thành sinh vật phá hoại lúa nghiêm trọng. Đến nay, diệt ốc bươu vàng triệt để là việc không thể dù hàng năm Nhà nước đã tốn nhiều tỷ đồng.

Bên cạnh những tác hại, thì về một khía cạnh thực tiễn nào đó, ốc bươu vàng lại là động vật có lợi. Ốc bươu vàng là nguồn thức ăn có hiệu quả kinh tế cao đối với chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ hải sản; đặc biệt là nuôi tôm, vì chúng có hàm lượng dinh dưỡng và can-xi rất cao. Về mặt hóa sinh học, ốc bươu vàng là nguồn nguyên liệu tự nhiên rất giàu Acetylcholinesterase (AChE). AChE là một enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong vận truyền tín hiệu của hệ thần kinh động vật.

Trung tâm hoạt động của AChE có các nhóm chức và cấu trúc không gian phù hợp với các hợp chất phospho hữu cơ nên rất dễ kết hợp với các chất này và mất hoạt tính rất nhanh. Nắm được tính chất này, người ta đã sản xuất các chất ức chế AChE là phospho hữu cơ làm chất độc hóa học vô cùng nguy hiểm sử dụng trong chiến tranh như Tabun, Cyclosarin, Sarin, Soman, VX cũng như làm thuốc bảo vệ thực vật sử dụng trong sản xuất nông nghiệp. Sau khi sử dụng, chất độc hóa học sẽ tồn dư lại trong môi trường đất, nước, trong các sản phẩm nông nghiệp (thực phẩm, rau, củ, quả v. Chúng là những chất vô cùng độc hại đối với môi trường sinh thái, ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, động vật và còn có thể là những tác 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm, trong đó có bệnh ung thư.

Vì vậy, việc phân tích phát hiện nhanh các chất độc hóa học là rất cần thiết, đặc biệt ngày nay các chất độc này được người dân sử dụng tràn lan. Dựa trên tính chất của chất ức chế, chúng ta có thể nghiên cứu sử dụng enzyme AChE làm phương tiện phân tích, phát hiện nhanh các chất độc hóa học phospho hữu cơ. Kế thừa các thành quả nghiên cứu về ốc bươu vàng của những nhà khoa học trên thế giới, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch, tính chất đặc trưng và ứng dụng của Acetylcholinesterase từ ốc bươu vàng”. Mục đích chính của đề tài là tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào trong nước; nghiên cứu, khai thác, ứng dụng AChE làm phương tiện phát hiện nhanh một số loại thuốc trừ sâu phospho hữu cơ tồn dư trong lương thực, thực phẩm.

Với mục đích nêu trên, đề tài của chúng tôi không những có ý nghĩa về khoa học và thực tiễn mà còn có ý nghĩa về mặt kinh tế, sử dụng hợp lý tài nguyên; đặc biệt là đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả bảo vệ môi trường sinh thái. Để đạt được mục tiêu nêu trên chúng tôi tiến hành thực hiện các nội dung chính sau: 1. Tìm hiểu các đặc điểm sinh học của ốc bươu vàng, đặc biệt là enzyme AChE từ đối tượng này. Khảo sát các điều kiện sinh thái, môi trường sống ảnh hưởng đến khả năng sinh AChE của ốc bươu vàng.

Nghiên cứu tinh sạch và các tính chất đặc trưng của AChE từ ốc bươu vàng. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại chất độc hóa học tới hoạt độ của AChE từ ốc bươu vàng. Nghiên cứu sử dụng AChE để xây dựng phương pháp phát hiện nhanh một số loại thuốc trừ sâu phospho hữu cơ tồn dư trong lương thực, thực phẩm. 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Ốc bươu vàng có tên khoa học là Pomacea canaliculata thuộc họ Pilidae, lớp chân bụng (Gastropoda), ngành thân mềm (Mollusca), có nguồn gốc từ Trung và Nam Mỹ [15, 24]. Ốc trưởng thành có kích thước lớn, dạng mập tròn gồm đầu, thân và chân. Đầu có hai đôi xúc tu (một đôi dài và một đôi ngắn), thân nằm trên chân, là một khối xoắn ẩn kín trong vỏ; chân rộng, hình đĩa, màu trắng kem nằm ở phía bụng, mặt lưng của chân có nắp vỏ che đậy, đầu và chân thường thò ra ngoài vỏ khi di chuyển. Toàn bộ cơ thể ốc nằm trong lớp vỏ.

Con đực có nắp miệng hơi nhô gợn sóng, con cái có nắp miệng bằng phẳng hơi lõm xuống. Sau khi thụ tinh xong, ốc bươu vàng thường đẻ trứng vào chiều tối. Khi đẻ, ốc leo lên giá thể cao trên mặt nước, trứng có màu hồng bám thành chùm trên giá thể và mỗi lần đẻ có khoảng 150 - 500 trứng (1 chùm); sau khoảng 12 - 15 ngày thì trứng nở và nở hết trong 2 - 7 ngày. Tỉ lệ nở khoảng 70%, tỉ lệ sống sau 10 ngày tuổi khoảng 80%.

Tuổi thành thục sớm (khoảng 100 ngày sau khi nở), thời gian tái phát dục ngắn, khoảng 3 ngày. Trong quần đàn, tỉ lệ con đực/cái khoảng 1/4. Ốc bươu vàng là loài có tốc độ sinh sản rất nhanh, kích thước của buồng trứng phản ánh kích thước cơ thể của con cái. Có nghĩa là nếu số lượng trứng nhiều, buồng trứng lớn thì kích thước của con cái lớn [54].