Luận án: Đột biến và đa hình gen yếu tố IX ở bệnh nhân Hemophilia B - Vũ Thị Bích Hường

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VŨ THỊ BÍCH HƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG ----------------------------- VŨ THỊ BÍCH HƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 9 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. DƯƠNG QUỐC CHÍNH Viện Huyết học – Truyền máu TW 2.ĐỒNG VĂN QUYỀN Viện Công nghệ sinh học NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B LỜI CAM ĐOAN Tôi là Vũ Thị Bích Hường, nghiên cứu sinh khóa II, năm 2016, chuyên ngành Di truyền học, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của hai thầy TS. Dương Quốc Chính và PGS.

Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày 9 tháng 8 năm 2022 Người viết cam đoan BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM NCS.

Vũ Thị Bích Hường NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Đảng Ủy, Ban Lãnh đạo Viện Huyết học – Truyền máu TW đã cho phép tôi được dự tuyển, tham gia khóa đào tạo Tiến sĩ và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Dương Quốc Chính, Phó trưởng bộ môn Huyết học – Truyền máu, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội; Trưởng khoa Di truyền & Sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu TW, người Thầy đã định hướng nghiên cứu, trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu; hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất để tôi thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.

Đồng Văn Quyền, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Thị Mai, Giám đốc Trung tâm hemophilia; các bác sỹ, điều dưỡng tại Trung tâm hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW; tập thể cán bộ khoa Tiếp nhận máu đã hợp tác và hỗ trợ tôi trong quá trình thu thập mẫu nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bệnh nhân hemophilia B, người nhà bệnh nhân và người hiến máu đã giúp đỡ để tôi có được các số liệu trong luận án này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ban giám đốc, Phòng đào tạo Học viện Khoa học và Công nghệ; Khoa Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi, hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. - Các thầy cô tham gia giảng dạy trong chuyên ngành Di truyền học, đã truyền đạt kiến thức quý báu cho tôi trong quá trình học tập. NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B - ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn tôi để hoàn thành mọi thủ tục hành chính trong suốt quá trình học tập tại Học viện.

Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp yêu quý tại Khoa Di truyền & Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu TW đã luôn sẵn sàng hỗ trợ, chia sẻ với tôi trong suốt quá trình thực hiên nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin chân thành biết ơn gia đình đã luôn ở bên tôi, cổ vũ, động viên và là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập và thực hiện luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 9 tháng 8 năm 2022 Người viết cam đoan NCS. Vũ Thị Bích Hường NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC v DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x DANH MỤC BẢNG ix MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1. Tổng quan về bệnh hemophilia B 4 1. Một số dấu mốc về lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh hemophilia B 4 1. Khái quát về bệnh hemophilia B 6 1.

Cấu trúc và chức năng của yếu tố IX trong quá trình đông máu 10 1. Các yếu tố đông máu 10 1. Vai trò của yếu tố IX trong quá trình đông máu 11 1. Cấu trúc yếu tố IX và quá trình hoạt hóa yếu tố IX 13 1.

Mối tương tác giữa yếu tố IX với các nhân tố hoạt hóa và đồng yếu tố 15 1. Phân tích di truyền bệnh hemophilia B 18 1. Vai trò của phân tích di truyền trong bệnh hemophilia B 18 1. Đặc điểm đột biến trên gen F9 19 1.

Đặc điểm các đa hình nucleotide liên kết với gen F9 27 1. Các kỹ thuật phân tích di truyền trong bệnh hemophilia B 30 1. Kỹ thuật phân tích đột biến 31 1. Kỹ thuật phân tích liên kết 36 1.

Tình hình nghiên cứu về các biến đổi di truyền trên gen F9 38 1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 38 1. Tình hình nghiên cứu trong nước 42 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B 2.

Đối tượng nghiên cứu 45 2. Phương pháp nghiên cứu 46 2. Thiết kế nghiên cứu 46 2. Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình nucleotide 46 2.

Các bước nghiên cứu 46 2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 50 2. Vật tư – Trang thiết bị 51 2. Thu thập mẫu nghiên cứu 52 2.

Tách chiết ADN 52 2. Thiết kế các trình tự mồi để khuếch đại gen tổng hợp yếu tố IX 52 2. Khuếch đại các phân đoạn a1-a8 bằng kỹ thuật Longrange PCR 53 2. Tinh sạch sản phẩm Longrange PCR khuếch đại các vùng gen F9 54 2.

Khẳng định kết quả giải trình tự gen F9 trên NGS 55 2. Khẳng định các mất đoạn/lặp đoạn gen F9 bằng kỹ thuật MLPA 56 2. Phân tích đột biến gen từ dữ liệu giải trình tự 56 2. Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9 từ dữ liệu giải trình tự 58 CHƯƠNG 3.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 60 3. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 60 3. Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu 61 3. Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX 62 3.

Thiết kế bộ mồi khuếch đại toàn bộ gen F9 62 3. Tối ưu quy trình LR- PCR khuếch đại 8 vùng gen F9 63 3. Chuẩn bị thư viện ADN 67 3. Giải trình tự với quy trình NGS đã tối ưu 68 3.

Khẳng định kết quả giải trình tự NGS 70 3. Giải trình tự gen F9 ở các mẫu nghiên cứu 73 3. Phân tích đột biến gen ở 100 bệnh nhân nghiên cứu 76 3. Kiểu đột biến gen 80 NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B 3.

Tác động của các đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen 80 3. Đánh giá mức độ lặp lại của các đột biến ở các bệnh nhân nghiên cứu 81 3. Tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh 82 3. Lập bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam 83 3.

Phân bố đột biến trên gen F9 83 3. Phân bố của các đột biến trên các domain của phân tử FIX 84 3.3 Bản đồ đột biến gen F9 của bệnh nhân hemophilia B Việt Nam 84 3. Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9 1 3. Khảo sát đa hình nucleotide trên gen mã hoá yếu tố IX 1 3.

Tần suất alen đa hình trong quần thể người bình thường 1 3. Phân tích liên kết giữa các đa hình nucleotide 2 3. Lựa chọn bộ đa hình có giá trị thông tin cao 6 3. Xác nhận hiệu quả của bộ đa hình trên gia đình người bệnh 7 CHƯƠNG 4.

BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 9 4. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 9 4. Xây dựng quy trình NGS giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX 11 4. Thiết kế bộ mồi khuếch đại gen F9 11 4.

Tối ưu quy trình LR-PCR khuếch đại 8 vùng gen F9 12 4. Chuẩn bị thư viện ADN 14 4. Giải trình tự gen F9 với quy trình đã tối ưu 14 4. Đánh giá kết quả giải trình tự NGS 15 4.

Giải trình tự gen F9 của các mẫu nghiên cứu 15 4. Phân tích đột biến gen của 100 bệnh nhân nghiên cứu 16 4. Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp trong nghiên cứu 20 4. Mối tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh 21 4.

Bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam 22 4. Phân bố đột biến trên gen F9 22 4. Phân bố đột biến trên phân tử protein yếu tố IX 23 4. Đa hình di truyền trên gen F9 26 NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B 4.

Khảo sát đa hình nucleotide trên gen F9 26 4. Tần suất alen đa hình trong nghiên cứu 28 4. Phân tích mối liên kết di truyền giữa các đa hình nucleotide 30 4. Lựa chọn bộ đa hình có giá trị thông tin cao 31 4.