Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng vào sản

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI -- -- HOÀNG THỊ LỆ THƯƠNG NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO SẢN XUẤT RƯỢU BRANDY TỪ QUẢ DỨA Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Quang Hào TS. Trần Thị Thuý Hà Nội - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả của đề tài Luận án Tiến sỹ: Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng vào sản xuất rượu brandy từ quả dứa” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả và số liệu trình bày trong Luận án là trung thực, chưa được công bố trong bất cứ nghiên cứu của các tác giả trước đây.

Các bài báo khoa học được công bố với sự cho phép, đồng ý của các đồng tác giả. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về công trình nghiên cứu này. Tác giả Hoàng Thị Lệ Thương LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Cô hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Quang Hào và TS.

Trần Thị Thúy đã luôn tận tâm giúp đỡ, hướng dẫn, động viên tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn GS. Nguyễn Thành Đạt, PGS. Dương Minh Lam, PGS.

Đoàn Văn Thược, TS. Phan Duệ Thanh, ThS. Tống Thị Mơ, CN. Phạm Thị Hồng Hoa đã những góp ý và những hỗ trợ tinh thần quan trọng trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành cảm ơn tập thể Bộ môn CNSH – Vi sinh, Khoa Sinh học, trường Đại học Sư Phạm Hà Nội; Bộ môn Hóa – Sinh, Khoa Khoa học cơ bản; Ban Giám hiệu Trường Đại học Tân Trào – Tuyên Quang đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Công ty cổ phần Thực phẩm xuất khẩu Đồng Giao; Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghệp thực phẩm; Phòng Phân tích hóa học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viên Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Kiểm Nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, đã hỗ trợ tôi trong quá trình thu thập mẫu, thu thập số liệu, phân tích kết quả một số thí nghiệm. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các đồng nghiệp, gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 18 tháng 8 năm 2020 Tác giả Hoàng Thị Lệ Thương MỤC LỤC MỞ ĐẦU.

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU. Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm men trong trong lên men rượu. Đặc điểm sinh học của nấm men. Phân loại, tiêu chí tuyển chọn các chủng nấm men thường dùng để sản xuất brandy.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển và lên men của nấm men. Cải biến chủng nấm men. Dứa – nguyên liệu để sản xuất Brandy dứa. Nguồn gốc của cây dứa.

Sơ lược tình hình trồng và chế biến dứa. Đặc điểm sinh học và thành phần dinh dưỡng của dứa. Công nghệ sản xuất rượu Brandy. Lịch sử nghiên cứu và sản xuất rượu brandy.

Sản xuất vang để chưng cất thu brandy. Chưng cất rượu vang để thu brandy. Tàng trữ và tạo hương cho brandy. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng brandy Việt Nam .45 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị. Hoá chất và môi trường. Chủng giống vi sinh vật. Thiết bị nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp vi sinh. Phương pháp hoá lý. Phân tích cảm quan rượu.

Phương pháp phân tích và xử lý số liệu. 72 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men từ dịch ép dứa Queen. Phân lập nấm men trong môi trường dịch ép dứa Queen.

Tuyển chọn chủng nấm men. Đặc điểm sinh học của chủng nấm men D8 tuyển chọn. Hình thái của khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng nấm men D8. Đặc điểm sinh hóa – sinh lý của chủng nấm men D8.

Xác định tên khoa học của chủng D8. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm men S. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang dứa. Thành phần hóa học cơ bản của dịch dứa ép.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang dứa. Sản xuất brandy dứa ở quy mô thực nghiệm (100 lít )bằng chủng S. Cải biến chủng nấm men S. cerevisiae D8 bằng kĩ thuật đột biến ngẫu nhiên.

Tác dụng gây chết của hóa chất NTG, tia cực tím UV và kết hợp NTG với UV đến tế bào nấm men S. Hoạt lực lên men ethanol của các biến chủng. Chưng cất, làm sạch, tàng trữ và tạo hương. Chưng cất và làm sạch rượu.

Tàng trữ và tạo hương đặc trưng cho brandy dứa bằng gỗ sồi. 125 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 139 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 141 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

142 PHỤ LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Diễn giải Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt 2KG Calcium-2; keto-gluconate Calcium-2; keto-gluconate ADO Adonitol (ribitol) Adonitol (ribitol) ARA L-arabinose L-arabinose CEL Cellobiose Cellobiose CFU Colony Forming Units Đơn vi hình thành khuẩn lạc Da Dalton Dalton DNS 3,5- Dinitrosalicylic acid 3,5- Dinitrosalicylic acid Nồng độ hoạt chất làm giảm 50% tốc EC50 Effective Concentration độ sinh trưởng của Vi Sinh Vật GAL D-galactose D-galactose Gas Chromatography Mass Hệ thống mãy phân tích sắc kí khí – GC-MS spectrophotometer khối phổ GLU D-glucose D-glucose GLY Glycerol Glycerol INO Inositol Inositol LAC D-lactose D-lactose MAL D-maltose D-maltose MDG Methyl-α D-glucopyranoside Methyl-α D-glucopyranoside MLZ D-melezitose D-melezitose NAG N-acetyl-glucosamine N-acetyl-glucosamine N-methyl-N-nitro-N- NTG N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine nitrosoguanidine RAF D-raffinose D-raffinose S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SAC D-saccharose D-saccharose SOR D-sorbitol D-sorbitol TRE D-trehalose D-trehalose UV Ultraviolet Tia cực tím UV-VIS Ultraviolet - visible Thiết bị quang phổ hấp thụ phân tử V/V Volume/Volume = Vol. Thể tích/ thể tích VSV Microbiology Vi sinh vật Vietnam Type Cultrure VTCC Bộ sưu tập giống chuẩn Việt Nam Colection WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới XLT Xylitol Xylitol XYL D-xylose D-xylose DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Thành phần các chất hữu cơ cơ bản trong tế bào nấm men [146].

Một số enzyme quan trọng trong nấm men [149]. Thành phần hoá học của một số giống dứa chủ yếu ở nước ta [10] 5. Thành phần dinh dưỡng trong 100 g thịt quả dứa trồng ở Trung Mỹ [100]. Thành phần hóa lý và cảm quan của brandy dứa 41% [11].

Thành phần hóa lý và cảm quan của brandy dứa 29% [11]. Xếp hạng chất lượng sản phẩm - TCVN 3217 – 1979 [2]. Các chỉ tiêu hóa học của rượu chưng cất – TCVN 7043:2013 [3]. Giới hạn tối đa hàm lượng kim loại nặng đối với đồ uống có cồn - TCVN 7043:2013 [3].

Thể tích dịch men giống các chủng nấm men tuyển chọn (D1- D8 được dùng bổ sung vào bình lên men để đạt 13,4×106 tế bào/ ml. Tiêu chuẩndung dịch McFarland ở bước sóng 600nm (12/10/2014), được đo tại Phòng thí nghiệm UCRF DeRisi:. Bảng mẫu thử và dung dịch furfurol chuẩn. Yêu cầu cảm quan đối với rượu chưng cất - TCVN 3217 – 79 [2].

Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu cảm quan [2]. Bảng chuyển đổi điểm cảm quan có trọng số [2]. Mức chất lượng cảm quan của rượu [2]. Mật độ tế bào của 8 chủng nấm men trong bình nhân .73 giống và thể tích dịch nhân giống cần lấy để bổ sung vào bình lên men.

Hoạt lực lên men ethanol và khả năng tạo hương của 8 chủng nấm men phân lập. Khả năng lên men của 4 chủng nấm men D3, D4, D5, D8 .75 ở các môi trường có pH thấp. Khả năng lên men đường của chủng D8 và chủng TCCY bằng kit API C 20 AUX. Khả năng lên men đường của chủng D8 và chủng TCCY bằng kit API ID 32 C.

Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường đến quá trình nhân giống chủng S. Thành phần hóa học cơ bản của dịch ép dứa. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men dịch dứa. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men vang dứa.

Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men. Ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan ban đầu trong dịch lên men đến quá trình lên men vang dứa. Ảnh hưởng của lượng men giống đến quá trình lên men vang dứa. Động thái của quá trình lên men dịch dứa trong 24 giờ đầu quy mô 20 lít/mẻ.

Hoạt lực lên men ethanol của các biến chủng đã được xử lý đột biến bằng NTG. Hoạt lực lên men ethanol của các biến chủng được xử lý đột biến tích lũy (kết hợp NTG và UV). Khả năng lên men trong môi trường có hàm lượng đường cao của biến chủng tích lũy NU 120.4 và chủng nấm men S. Lên men ethanol bằng biến chủng tích lũy NU 120.

Sự liên quan giữa lượng rượu đầu được ngắt ra với hàm lượng aldehyde và acid còn lại trong rượu giữa. Thành phần brandy dứa được làm sạch bằng phương pháp hóa học trong môi trường acid có pH khác nhau. Biến động về màu sắc, mùi, vị của brandy dứa trong quá trình tàng trữ 24 tháng với gỗ sồi (dạng thanh và dạng bột). Một số thành phần hương chính của brandy dứa trắng sau 24 tháng tàng trữ không có gỗ sồi.

Thành phần hương của brandy dứa được tàng trữ 24 tháng với bột gỗ sồi thương mại (4g/l) .131 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Quy trình sản xuất brandy nho (Viện Nghiên cứu Bông và phát triển nông nghiệp Nha Hố) [21]. Cơ chế quá trình lên men rượu ethanol [63]. Hệ thống nồi chưng cất brandy [116].

Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng đường khử glucose theo phương pháp DNS. Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng furfurol. Khuẩn lạc của chủng D8 trên môi trường Hansen đặc ở 28oC sau 96 h nuôi cấy. Hình dạng tế bào của chủng D8 trên môi trường Hansen đặc sau 96h nuôi cấy ở 28oC (chụp dưới kính hiển vi điện tử S4800-NHE).

Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường đến quá trình nhân giống chủng S. Ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến quá trình nhân giống. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình nhân giống nấm men S. Ảnh hưởng của (NH 4 )2 SO4 đến quá trình nhân giống chủng S.

Ảnh hưởng của pepton đến quá trình nhân giống chủng S.