Luận án tiến sĩ sinh học: Phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện vi khuẩn bệnh viện và khảo sát kháng kháng sinh - Nguyễn Thị Loan (Học viện Khoa học và Công nghệ)

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý cho phép của đồng tác giả. Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin đảm bảo tính khách quan và kết quả xử lý số liệu trong nghiên cứu này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Loan ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Lã Thị Huyền, Trƣởng phòng Công nghệ tế bào động vật- Viện CNSH và PGS. Nguyễn Minh Hiền, Trƣởng khoa Sinh hoá - Bệnh viện Thanh Nhàn là những ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Các Cô đã chỉ bảo cho tôi nhiều ý kiến hƣớng dẫn qúy báu, động viên và giúp đỡ tôi giải quyết những khó khăn vƣớng mắc trong quá trình thực hiện luận án và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn tới tập thể cán bộ nghiên cứu phòng Công nghệ tế bào động vật - Viện CNSH - Viện Hàn Lâm KH và CN Việt Nam đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các anh chị ở khoa Sinh hoá, khoa Vi sinh, khoa Hồi sức tích cực, bệnh viện Thanh Nhàn, khoa Hồi sức tích cực bệnh viện Đức Giang, đặc biệt là em Nguyễn Trọng Linh đã luôn đồng hành cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô khoa CNSH - Học viện KH và CN, các thầy cô trong hội đồng nghiên cứu sinh đã nhiệt tình dạy bảo và giúp đỡ tôi, cho tôi các ý kiến quí báu để sửa chữa và hoàn thiện luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi chuyên tâm làm việc và hoàn thành luận án.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, các đồng nghiệp ở Khoa Nông- Lâm trƣờng Đại học Hoa Lƣ đã luôn động viên và giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và công tác. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Tác giả NCS. Nguyễn Thị Loan iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan …………………………………………………………………… i Lời cảm ơn………………………………………………………………………. ii Mục lục ……………………………………………….

iii Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt …………………………………………. v Danh mục các bảng …………………………………………………….……… vi Danh mục các hình………………………………………………………. viii MỞ ĐẦU…………………………………………………………………. Tình hình và căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện ….

Lịch sử phát hiện và nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện ……. Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện hiện nay ……………………………. Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện ……………………. Một số kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện ….

Cấy máu và xét nghiệm sinh hoá ………………………………………. Kỹ thuật xác định sự có mặt của DNA …………… ………………………… 11 1. Tình hình nghiên cứu ứng dụng multiplex realtime PCR xác định các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện …………………………… 15 1. Trên thế giới …………………………………………………………….

Kháng sinh và kháng kháng sinh ở vi khuẩn ……………. Kháng sinh và cơ chế tác động …………………………………………. Kháng kháng sinh của vi khuẩn và cơ chế kháng kháng sinh …………. Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn trên thế giới và ở Việt Nam… 28 CHƢƠNG 2.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2. Đối tƣợng nghiên cứu ……………………………………………. Các mẫu bệnh phẩm……. Cách tính cỡ mẫu nghiên cứu ………………………………………….

Nguyên vật liệu nghiên cứu …………………………………………. Nguyên vật liệu ………………………………………………………… 36 iv 2. Phƣơng pháp nghiên cứu ……………………………………. Nhóm phƣơng pháp vi sinh truyền thống …………………………….

Phƣơng pháp sinh học phân tử …………………………………………. Phƣơng pháp kiểm tra độ nhậy, độ đặc hiệu, độ ổn định, ngƣỡng phát hiện của bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR ………………………. Phƣơng pháp thống kê …………………………………………………. Đạo đức nghiên cứu …………………………………………………… 48 CHƢƠNG 3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………………. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật gây nhiễm khuẩn bệnh viện …. Kết quả phân bố xét nghiệm theo loại bệnh phẩm …………………. Tỉ lệ các loại vi sinh vật phân lập đƣợc ………………………………… 52 3.

Kết quả phân tích gen 16S rARN từ các chủng vi khuẩn phân lập ……. Kết quả phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR xác định đồng thời 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Kết quả lựa chọn, phân tích trình tự gen đích …………………………. Kết quả thiết kế mồi và mẫu dò ………………………………………… 58 3.

Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò với gen đích ………. Kết quả phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn ……. Kết quả tối ƣu phản ứng realtime PCR …………. Kết quả xác định ngƣỡng phát hiện …………………………………….

Kết quả tạo các đối chứng dƣơng ……………………. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu ………………………………. Kết quả xác định độ ổn định …………………………………………… 87 3. Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn nghiên cứu và gen mã hoá beta-lactamase mở rộng của vi khuẩn E.

Kết quả kháng sinh đồ …………………………………………………. Kết quả xác định gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng của E. 98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………. 105 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ Ac Acinetobacter baumannii BV Bệnh viện Ct Thresold cycle (chu kì ngƣỡng) CTX-M Cefotaxime- Munich DNA Deoxyribonucleic Axit Ec Escherichia coli ECDC European Centre for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Châu Âu) ESBL Extended-Spectrum Beta-lactamase (beta-lactamase phổ rộng) FN Fall Negative (âm tính giả) FP Fall Positive (dƣơng tính giả) GADPH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase HAI Hospital Aquired- Infections Hu Human I Intermediate (trung gian) Kp Klebsiella pneumoniae MRSA Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus MSSA Methicillin- Susceptible Staphylococcus aureus NK Nhiễm khuẩn NKBV Nhiễm khuẩn bệnh viện Pa Pseudomonas aeruginosa PCR Polymerase Chain Reaction S Sensitivity (nhạy cảm) Sa Staphylococcus aureus R Resistant (đề kháng) VSV Vi sinh vật WHO World Healthy Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.

Tỷ lệ các tác nhân vi khuẩn gây NKBV ………………………………. Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn thƣờng gặp ………. Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn có tỷ lệ cao nhất …. Trình tự các cặp mồi, mẫu dò và gen đích của các chủng vi khuẩn …… 37 Bảng 2.

Trình tự mồi 16S rARN và gen mã hoá ESBL ………………………. Thành phần và chƣơng trình chạy phản ứng PCR …………………. Thành phần phản ứng mutiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò với DNA đích …………………. Thành phần phản ứng mutiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn …………………………… 45 Bảng 2.

Thành phần phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn … 45 Bảng 2. Thành phần phản ứng realtime PCR trên mẫu chủng chuẩn …………. Tỷ lệ xét nghiệm và tỷ lệ cấy dƣơng tính theo loại bệnh phẩm ………. Tỷ lệ phân lập vi sinh vật theo loại bệnh phẩm ……………………….

Các mồi và mẫu dò cho phản ứng realtime PCR ………………. Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu của từng cặp mồi, mẫu dò với DNA của vi khuẩn A. pneumoniae và DNA ngƣời ………. Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu của từng cặp mồi, mẫu dò với DNA của vi khuẩn S.

Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn A. pneumoniae và gen GADPH …………………………. Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dò với DNA của vi khuẩn E. Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn A.

pneumoniae và của ngƣời (Hu) ………. Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn E. Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR ở các nhiệt độ khác nhau ………………………………………. Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR với Master mix IDT và HQ ……………………………………………….

Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR với các nồng độ pha loãng …………………………………………………. So sánh phƣơng pháp multiplex realtime PCR và nuôi cấy theo mẫu bệnh phẩm …………………………………………………………. Kết quả phát hiện loại vi sinh vật bằng phƣơng pháp multiplex realtime PCR so sánh với phƣơng pháp cấy máu ……………………. Giá trị chu kì ngƣỡng của các mẫu khảo sát thời gian bảo quản.

Tỷ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa và Acinetobacter sp ………. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E. Tỷ lệ kháng kháng sinh của S.

Tính nhạy cảm kháng sinh của 5 chủng E. coli có mang gen ESBLs …………………………. 100 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1. Định nghĩa nhiễm khuẩn bệnh viện ………………….

Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn…. Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa các vi sinh vật……………. Cơ chế kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn………………………. Bản đồ về tình trạng kháng kháng sinh trên thế giới đến năm 2050 29 Hình 2.

Hình ảnh khuẩn lạc của các vi khuẩn trên môi trƣờng thạch máu… 50 Hình 3. Hình ảnh khuẩn lạc của các vi khuẩn trên môi trƣờng Chapman…. Hình ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số của các chủng S. Hình ảnh nhân bản gen 16S rARN từ DNA tổng số của một số chủng vi khuẩn A.

Hình ảnh nhân bản gen 16S rARN từ DNA tổng số của một số chủng vi khuẩn E. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tƣơng ứng ………………. Kết quả PCR nhân bản gen bla OXA -51 like của A. baumannii, gyrB của P.

aerruginossa, gen YccT của E. coli, gen Nuc của S. aureus và gen Cyt của K. Biểu đồ khuếch đại DNA của vi khuẩn (A): A.

baumannii, (B): Klebsiella pneumoniae và (C): GADPH của ngƣời ………………. Biểu đồ khuếch đại DNA của vi khuẩn (A): S. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hốn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn: ống đối chứng không có DNA ………. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích vi khuẩn (A): A.

pneumoniae và (C) 67 DNA ngƣời ………………………………………………… ix Hình 3. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn: ống có hốn hợp các DNA đích …………. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn ống không có đối chứng ………………… 68 Hình 3. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn ………………………………………….