Luận án tiến sĩ sinh học: Đa dạng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi. Các kết quả công bố trong luận án là trung thực, chính xác. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về số liệu, nội dung đã trình bày trong luận án. Hà Nội, ngày 27 tháng 4 năm 2022 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thùy Vân ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - Thầy PGS.TS Dƣơng Minh Lam, ngƣời thầy kính mến luôn tận tình hƣớng dẫn, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành tốt các công việc của luận án này.

TS Ngô Sỹ Hiền, ngƣời thầy luôn theo sát bên tôi, chỉ bảo tận tình và có những góp ý vô cùng quý báu trong quá trình nghiên cứu. - Quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học - Vi sinh, TS Trần Thị Thúy, PGS. TS Đoàn Văn Thƣợc, TS Phan Duệ Thanh, ThS Tống Thị Mơ, CN Phạm Thị Hồng Hoa về những góp ý, hỗ trợ tinh thần trong suốt quá trình tôi thực hiện nghiên cứu. - Quý thầy cô trong PTN Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội; Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp tôi rất nhiều trong việc thực hiện luận án.

TS Trƣơng Xuân Lam đã giúp đỡ tôi trong định loại mẫu côn trùng thu thập ở khu vực nghiên cứu. - Phòng Sau đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh - Đại học Sƣ phạm Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện luận án. - Ban Giám đốc Học viện Cảnh sát nhân dân, Lãnh đạo Khoa Kỹ thuật hình sự đã luôn động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. - Gia đình nhỏ, đồng nghiệp, bạn bè đã luôn yêu thƣơng, động viên, và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa học.

Hà Nội, ngày 27 tháng 4 năm 2022 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thùy Vân iii MỤC LỤC Trang phụ bìa LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT. vi DANH MỤC BẢNG .vii DANH MỤC HÌNH .viii MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU.

Nấm và nấm ký sinh côn trùng. Giới thiệu về nấm. Nấm ký sinh côn trùng. Nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide.

Đa dạng nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide. Con đƣờng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide ở nấm. Nhu cầu dinh dƣỡng và điều kiện nuôi cấy của nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy.

Tách chiết, tinh sạch và nghiên cứu cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng. Nghiên cứu cấu trúc. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Nguyên vật liệu và đối tƣợng nghiên cứu. Đối tƣợng nghiên cứu. Hóa chất và thiết bị. Môi trƣờng.

Phƣơng pháp nghiên cứu. Phƣơng pháp vi sinh vật học. Các phƣơng pháp sinh học phân tử. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch cyclooligomer depsipeptide.

Các phƣơng pháp phân tích. Phƣơng pháp toán học. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Đa dạng nấm ký sinh côn trùng phân lập từ mẫu thu ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn.

Kết quả phân lập và nghiên cứu đặc điểm của nấm ký sinh côn trùng ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn. Một số nhận xét về đa dạng các chủng nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn. Khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của các chủng nấm ký sinh côn trùng đã phân lập. Định loại chủng nấm CPA14V bằng đặc điểm hình thái và sinh học phân tử.

Đặc điểm hình thái của chủng nấm CPA14V. Định loại chủng nấm CPA14V bằng phƣơng pháp sinh học phân tử. Nghiên cứu môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng nấm C. Lựa chọn môi trƣờng lên men sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide.

Ảnh hƣởng của độ pH môi trƣờng đến sự sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng C. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng nấm C. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng nấm C. Nghiên cứu tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ C.

Tách chiết và tinh sạch cyclooligomer depsipeptide từ C. cateniannulata CPA14V ở quy mô phòng thí nghiệm. Xác định cấu trúc hóa học của cyclooligomer depsipeptide. Nghiên cứu khảo sát một số hoạt tính sinh học của các cao chiết tổng, phân đoạn và chất sạch beauvericin của chủng nấm C.

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro. Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. 125 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.128 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .130 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

I vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN: Acid deoxyribonucleotide ARN: Acid ribonucleotide CDW: (Cell dry weight): Sinh khối khô COD: Cyclooligomer depsipeptide CzD: Môi trƣờng Czapek – Dox EDTA: Ethylendiamin Tetra Acetic Acid FDM: Môi trƣờng xác định Fusarium HPLC: (High Performance Liquid Chromatography): Sắc kí lỏng hiệu năng cao áp IC50: (Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế 50% KBTTN: Khu bảo tồn thiên nhiên MIC: (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu MM: Môi trƣờng khoáng tối thiểu NCBI: National Center for Biotechnology Information NMR: (Nuclear Magnetic Resonance): Quang phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NRPSs Nonribosomal peptide synthetases PBG: Môi trƣờng dịch chiết khoai tây TLC: (Thin Layer Chromatography): Sắc kí bản mỏng TSB: Trypcase Soya Broth SBR: Môi trƣờng Sabouraud SDB: Sabouraud Dextrose Broth UV: (Untraviolet and Vissible Spectra): Tia tử ngoại VQG: Vƣờn quốc gia vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Một số cyclooligomer depsipeptide (COD) phổ biến ở nấm. Khả năng ức chế sự sinh trƣởng của tế bào ung thƣ của một số COD. Khả năng kháng khuẩn của beauvericin.

Thành phần một số loài thuộc chi Beauveria, Fusarium và Isaria sinh tổng hợp COD. Môi trƣờng lên men thu nhận COD. Các trình tự đƣợc sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài trên ba vùng gen ITS, LSU, Rpb1. Phƣơng pháp thực nghiệm khảo sát và thí nghiệm sau khảo sát tách chiết, tinh sạch COD.

Thành phần nấm ký sinh côn trùng phân lập đƣợc. Khả năng sinh tổng hợp COD của các chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập đƣợc ở khu vực nghiên cứu. Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của CC1 và tài liệu tham khảo. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của cao chiết và beauvericin từ chủng nấm C.

Hoạt tính chống oxi hóa in vitro của cao chiết và beauvericin từ chủng nấm C. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định in vitro của cao chiết và beauvericin từ chủng nấm C. 126 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc một số loại cyclooligomer depsipeptide.

Cấu trúc chung của các liên kết este giữa nhóm carboxyl C-terminus α- hydroxy acid, ß-hydroxy acid và hydroxy- acid chuỗi dài. Cấu trúc Pseudoxylallemycin. Cấu trúc một số diketomorpholine. Sinh tổng hợp COD.

Con đƣờng sinh tổng hợp beauvericin. Đồ thị đƣờng chuẩn xác định COD tích lũy theo. Hình thái mẫu CPA1. Hình thái mẫu CPA3.

Hình thái mẫu CPA5. Hình thái mẫu CPA13V. Hình thái mẫu CPA14V. Hình thái mẫu CPA15.

Hình thái mẫu CPA16. Hình thái mẫu CPA31. Hình thái mẫu CPA40. Hình thái mẫu CPA44.

Hình thái mẫu XS01. Hình thái mẫu XS07. Hình thái mẫu XS12. Hình thái mẫu XS36.

Hình thái mẫu XS37. Hình thái mẫu XS38. Hình thái mẫu XS57. Hình thái mẫu XS65.

Hình thái mẫu XS66. Hình thái mẫu XS67. Hình thái mẫu XS69. Hình thái mẫu XS71.

Hình thái mẫu XS77. Hình thái mẫu XS83. Mối quan hệ phát sinh chủng loại của các chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập tại khu vực nghiên cứu. Sắc ký đồ HPLC UV 203 nm của chất chuẩn (A).

Đặc điểm hình thái của chủng Cordyceps sp. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên vùng gen. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên vùng gen LSU. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên 3 vùng gen ITS1-5.8S rDNA-ITS2, LSU và Rpb1.

Khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp COD của chủng nấm C. cateniannulata CPA14V trong 05 loại môi trƣờng nghiên cứu. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp COD của chủng C. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp COD của chủng C.

Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp COD của chủng C. Quy trình thu nhận COD (CC1) quy mô phòng thí nghiệm. Ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hàm lƣợng CC1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hàm lƣợng CC1.

Ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến hàm lƣợng CC1. Phổ LC/MS Q-TOF của CC1. Phổ 1H-NMR của CC1. Phổ 13C-NMR, phổ DEPT, phổ HSQC của CC1.

Phổ COSY, phổ NOESY và phổ HMBC của CC1. Cấu trúc hóa học, tƣơng tác 1H-1H COSY và HMBC (HC) chính của CC1. Đặt vấn đề Nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic fungi - EPF) hay nấm côn trùng (Insect fungi) là nhóm nấm gây bệnh cho côn trùng [96]. Đây là nhóm nấm có vai trò rất quan trọng đối với hệ sinh thái.

Cho đến nay có gần 2000 loài nấm ký sinh côn trùng đƣợc ghi nhận [19, 222]. Nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp đa dạng các chất chuyển hóa thứ cấp nhƣ: Cyclic depsipeptide, peptide, dẫn xuất amino acid, polyketide, peptide hybrid, terpenoid… [48], [196]. Các chất chuyển hóa thứ cấp từ nấm ký sinh côn trùng có phổ hoạt tính mạnh đã và đang thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Trong đó đáng chú ý là nhóm hoạt chất cyclooligomer depsipeptide.

Cyclooligomer depsipeptide (COD) là một nhóm đặc biệt của nonribosomal peptid gồm 2, 3 hoặc 4 đơn phân. Trong đó mỗi đơn phân đƣợc cấu tạo bởi ít nhất một 2-hydroxycarboxylic acid và một 2-amino acid. COD đƣợc sinh tổng hợp nhờ hệ enzyme non-ribosomal peptide synthetase (NRPSs) [53]. COD là hoạt chất tự nhiên đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn [55], nấm [168], thực vật [207], tảo [46], hải miên [17], và một số loại sinh vật biển khác [92, 141].

Trong các nhóm COD thì COD từ nấm ký sinh côn trùng là một nhóm rất quan trọng, chiếm tỷ lệ lớn nhất [196].