Luận án tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do Leptospira interrogans gây ra - Nguyễn Tuấn Hùng

LỜI CÁM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới GS. Nghiêm Ngọc Minh - Nguyên Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen và PGS. Võ Thị Bích Thủy – Trưởng Phòng Hệ gen học vi sinh, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình và khích lệ động viên của các thầy hướng dẫn, đây chính là động lực lớn lao giúp tôi không ngừng phấn đấu và cố gắng vượt qua nhiều khó khăn để có thể hoàn thành Luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp tại Phòng Hệ gen học vi sinh, Phòng R&D Công ty Vetvaco đã luôn tạo điều kiện thuận lợi, đồng hành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại đơn vị. Bằng những tình cảm chân thành nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Trong quá trình nghiên cứu và học tập, tôi đã nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các nhà khoa học, cán bộ nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Những nhận xét và góp ý chuyên môn sâu sắc trong các buổi báo cáo, hội thảo đã giúp tôi hoàn thiện tốt nhất Luận án của mình.

Nhân dịp này, tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, tập thể cán bộ Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại đây. Sau cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn đồng hành và là nguồn động viên tinh thần lớn lao đối với tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành Luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Nguyễn Tuấn Hùng LỜI CAM ĐOAN Tôi là: Nguyễn Tuấn Hùng, nghiên cứu sinh Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, chuyên ngành Công nghệ sinh học xin cam đoan: 1- Đây là Luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy: PGS.TS Võ Thị Bích Thủy và GS.TS Nghiêm Ngọc Minh. 2- Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã đƣợc công bố tại Việt Nam.

3- Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã đƣợc xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Nguyễn Tuấn Hùng DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng Việt µl Microliter Micro Lít APS Ammonium persulphate Ammonium persulphate bp Base pair Cặp bazơ BSA Bovine serum albumin Huyết thanh bò CBB Coomasie Brilliant Blue Thuốc nhuộm gel SDS cs et.al Cộng sự dH2O Distilled water Nƣớc khử ion DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic DNase Deoxyribonuclease Enzyme nuclease Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotit dNTP Triphosphate Triphosphate E.coli Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli Ethylene Diamine Tetraacetace EDTA Axit aminopolycarboxylic Acid Isopropyl β-D-1- IPTG Chất cảm ứng biểu hiện gen thiogalactopyranosid Kb Kilobase Kilobasơ kDa Kilo Dalton Kilo Dalton LB Luria - Bertani Môi trƣờng LB LD50 Lethal Dose, 50% Liều gây chết 50% Xoắn khuẩn Leptospira L. interrogans Leptospira interrogans interrogans ml Milliliter Milli Lit OD Optical density Mật độ quang học PBS Phosphate buffer saline Nƣớc muối đệm phốt phát PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Polimeraza Từ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng Việt Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE polyacrylamide gel Điện di trên polyacrylamide electrophoresis TAE buffer Tris-acetate-EDTA Dung dịch đệm TAE Enzyme DNA polymerase chịu Taq Taq polymerase nhiệt TE Tris EDTA Đệm TE chứa Tris N,N,N,N- Hóa chất đƣợc sử dụng trong TEMED Tetramethylethylenediamine đúc gel polyacrylamide DANH MỤC CÁC BẢNG Số TT Tên Bảng Trang Bảng 1.

Nhóm huyết thanh và một số serovar của L. Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR trong nghiên cứu 32 Bảng 2. Hỗn hợp phản ứng PCR (10 µl) 33 Bảng 2. Thành phần phản ứng cắt vector 37 Bảng 2.

Thành phần phản ứng nối gen vào vector 38 Bảng 2. Thành phẩn gel acrylamide 40 Bảng 2. Công thức chia nhóm và dung dịch tiêm mẫm cảm 46 Bảng 2. Chuẩn bị các ống nghiệm và thêm vào các chất 48 Bảng 3.

Số lƣợng và trình tự các vùng giàu epitop của gen LipL21 đƣợc 66 dự đoán bằng các công cụ tin sinh Bảng 3. Trình tự mồi đặc hiệu nhân dòng đoạn gen LipL21 69 Bảng 3. Kết quả kiểm tra ngƣng kết với chất bổ trợ nhũ dầu 86 Bảng 3. Kết quả kiểm tra vô trùng vắc xin 87 Bảng 3.

Kết quả kiểm tra an toàn vắc xin trên động vật thí nghiệm 87 Bảng 3. Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin bằng phản ứng vi ngƣng kết 88 Bảng 3. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc 95 Bảng 3. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma 96 Bảng 3.

Kết quả kiểm tra tạp nhiễm Salmonella 97 Bảng 3. Kết quả kiểm tra an toàn vắc xin trên động vật thí nghiệm 98 Bảng 3. Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin bằng phản ứng vi ngƣng kết 99 Bảng 3. Kết quả tiêm thử nghiệm vắc xin trên bản động vật tại thực địa.

100 DANH MỤC CÁC HÌNH Số TT Tên Hình Trang Hình 1. Hình dạng Leptospira interrogans dƣới kính hiển vi điện tử quét 8 Hình 1. Leptospira interrogans dƣới KHV nền đen (x400) 9 Hình 1. Sơ đồ lây truyền Leptospira 13 Hình 1.

Tỷ lệ nhiễm Leptospirosis hàng năm 16 Hình 2. Chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR nhân gen 33 Hình 2. Mô tả quá trình tiêm vắc xin rLipL21 và đánh giá hiệu quả tạo 54 miễn dịch trên chuột thí nghiệm Hình 3. Hình ảnh sau khi ly tâm thu xoắn khuẩn 55 Hình 3.

Hình ảnh điện di DNA tổng số 56 Hình 3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR mồi 16S rRNA 56 Hình 3. Điện di đồ sản phẩm PCR mồi 16S rRNA sau tinh sạch 57 Hình 3. Hình ảnh trình tự một phần đoạn gen 16S rRNA của 5 chủng 58 Leptospira Hình 3.

Cây phát sinh chủng loại các chủng xoắn khuẩn nghiên cứu 59 o Hình 3. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi OmpL1 ở Tm 55 C 61 Hình 3. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LigA ở Tm 55 oC 61 o Hình 3. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LigB ở Tm 55 C 61 o Hình 3.

Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LipL21 ở Tm 50 C 61 Hình 3. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LipL32 ở Tm 50 oC 62 Hình 3. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LipL41 ở Tm50 oC 62 Hình 3. Điện di đồ sản phẩm nhân bản toàn bộ gen LipL21 63 Hình 3.

Điện di đồ sản phẩm PCR nhân bản gen LipL21 63 Hình 3. Trình tự nucleotit của gen LipL21 64 Hình 3. Trình tự axit amin của gen LipL21 65 Hình 3. Cấu trúc 3D gen LipL21 của 5 chủng xoắn khuẩn 65 Hình 3.

Tạo, sàng lọc và kiểm tra dòng tái tổ hợp pJET1.2-LipL21 ở tế 71 bào E.coli DH10b Hình 3. Kết quả so sánh trình tự gen LipL21 của 05 chủng Leptospira và 72 trình tự gen LipL21 trong plasmid Số TT Tên Hình Trang Hình 3. Tạo, sàng lọc và kiểm tra dòng tái tổ hợp pET32a-LipL21 ở tế 75 bào E.coli BL21 Hình 3. Kết quả so sánh trình tự gen LipL21 của Leptospira interogen và 76 trình tự gen LipL21 trong plasmid Hình 3.

Điện di đồ sản phẩm protein tái tổ hợp LipL21 ở E. coli BL21 77 Hình 3. Điện di đồ sản phẩm protein đƣợc biểu hiện trong các điều kiện 78 nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác nhau Hình 3. Điện di đồ sản phẩm protein đƣợc biểu hiện trong các điều kiện 79 nồng độ cảm ứng IPTG khác nhau.

Điện di đồ sản phẩm protein đƣợc biểu hiện trong các điều kiện 80 thời gian cảm ứng IPTG khác nhau Hình 3. Định lƣợng bằng Bradford các phân đoạn tinh sạch 81 Hình 3. Điện di đồ sản phẩm biểu hiện của pET32a-LipL21 81 ở E. coli BL2 đã tinh sạch Hình 3.

Kết quả ngƣng kết giữa kháng nguyên là protein tái tổ hợp 82 LipL21 với nồng độ khác nhau 100µg, 250µg, 500µg và kháng thể thu đƣợc từ thỏ Hình 3. Kết quả của phản ứng MAT giữa chủng Leptospira sống và 83 huyết thanh thu đƣợc Hình 3. Phản ứng vi ngƣng kết của protein tái tổ hợp LipL21 đƣợc phối 86 trộn với nhũ dầu với liều tiêm là 1ml và 2ml Hình 3. Tỷ lệ chuột tiêm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 sống/ chết sau công 89 cƣờng độc xoắn khuẩn Leptospira Hình 3.

Hình ảnh chụp các thay đổi mô bệnh học của thận và gan ở 89 chuột thí nghiệm Hình 3. Kết quả phản ứng Western blot giữa kháng nguyên tái tổ hợp 91 rLipL21 và kháng thể đặc hiệu Hình 3. Máy tạo nhũ L4RT (Hãng Silverson - Anh Quốc) 94 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của luận án 1 2.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án 2 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án 3 4. Những đóng góp mới của luận án 3 5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án 3 6.

Bố cục của luận án 3 CHƢƠNG 1. Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis 5 1. Đặc điểm sinh học của xoắn khuẩn Leptospira 5 1. Phân loại học 5 1.

Cấu trúc hình thái 8 1. Đặc tính nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira 8 1. Sức đề kháng của mầm bệnh 9 1. Tính sinh miễn dịch 10 1.

Đặc điểm dịch tễ học 11 1. Đường xâm nhập của mầm bệnh 12 1. Đặc tính gây bệnh của xoắn khuẩn Leptospira 13 1. Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis 14 1.

Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis trên thế giới 14 1. Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis trên gia súc và người ở 16 Việt Nam 1. Nghiên cứu hệ gen xoắn khuẩn Leptospira 18 1. Đặc điểm toàn bộ hệ gen xoắn khuẩn Leptospira 18 1.

Đặc điểm hệ gen quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn 19 Leptospira 1. Cơ chế tạo kháng thể trong cơ thể của xoắn khuẩn Leptospira 20 1. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis 22 1. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis trên 22 thế giới 1.

Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis tại 24 Việt Nam CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2. Nguyên liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 28 2.3 Trang thiết bị 29 2. Phƣơng pháp nghiên cứu 30 2.1 Tạo kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 mang các epitope 30 2.

Nuôi cấy, tăng sinh 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira 30 2.