Luận án tiến sĩ: Sàng lọc và biểu hiện gen ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium - Trần Thị Hồng (Học viện Khoa học và Công nghệ, 2020)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN THỊ HỒNG SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI, 2020 luan an BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN THỊ HỒNG SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia vesparium QT2 THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1.NCVCC Phạm Việt Cường 2.TS Nguyễn Thị Kim Cúc Hà Nội, 2020 luan an LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.NCVCC Phạm Việt Cường, nguyên Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam- Nhà Khoa học mẫn cán, người thầy mẫu mực- người đã giúp tôi định hướng nội dung, giúp đỡ về tinh thần, kiến thức chuyên môn, cơ sở vật chất và chỉ bảo tận tình giúp tôi vượt qua rất nhiều khó khăn để hoàn thành Luận án trong suốt những năm qua. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc, Chủ nhiệm đề tài ĐTĐLCN.17/14 “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên tại biển miền Trung Việt Nam nhằm phát hiện và sàng lọc các chất hoạt tính sinh học mới” đã định hướng cho luận án của tôi và quan tâm, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã cử tôi đi học, tập thể Trung tâm sinh học Phân tử Nghĩa Đô, Ths.NCS Tôn Thất Hữu Đạt, phòng quản lý tổng hợp Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã tạo điều kiện cho tôi làm việc, hoàn thành các thủ tục giấy tờ và hoàn thiện các nội dung trong nghiên cứu này. Tôi trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình học tập.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ, chia sẻ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận án của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả NCS. Trần Thị Hồng i luan an LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một số kết quả lần đầu tiên được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành có uy tín với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả NCS. Trần Thị Hồng ii luan an MỤC LỤC Lời cảm ơn .i Lời cam đoan .ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT. vi DANH MỤC CÁC BẢNG.

viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ. ix MỞ ĐẦU. Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên. Giới thiệu về hải miên.

Vi sinh vật liên kết hải miên. Sơ lược về metagenomics. Chất ức chế protease (PIs). Chất ức chế protease và phân loại.

Cơ chế hoạt động của PIs. Ứng dụng của chất ức chế protease. Tình hình nghiên cứu PIs từ vi sịnh vật liên kết với hải miên trong và ngoài nước. Hệ biểu hiện gen ngoại lai Escherichia coli và Pichia pastoris.

35 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu….

Dung dịch và môi trường sử dụng. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp tách DNA metagenome của VSV liên kết hải miên. 43 iii luan an 2.

Định danh hải miên bằng sinh học phân tử. Phân tích dữ liệu metagenomics. Tổng hợp gen PIs từ CSDL metagenomics hải miên và thiết kế plasmid mang gen PIs. Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện E.

Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện nấm men Pichia pastoris. Phương pháp xác định hoạt tính ức chế protease. Phương pháp xác định ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PIs tái tổ hợp. Phân tích thống kê.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Thu thập mẫu hải miên. Kết quả tách chiết DNA metagenome. Tách chiết DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị.

Định danh hải miên QT2 bằng sinh học phân tử. Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị, Việt Nam bằng tin sinh học. Lắp ráp reads của DNA metagenome. Kết quả dự đoán gen.

Kết quả chú giải và phân loại chức năng gen. Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị. Khai thác gen có hoạt tính ức chế protease (PIs) dựa trên cơ sở dữ liệu (CSDL) metagenomics. Nghiên cứu biển hiện ức chế protease (PIs) trong hệ Escherichia coli.

Phân tích trình tự a xít amin và cây phân loại của protein PI-QT. 76 iv luan an 3. Thiết kế vectơ biểu hiện pET-32a(+) mang gen PIs. Biểu hiện gen PIs trong E.

coli chủng BL21(DE3). Nghiên cứu điều kiện thích hợp nhất để thu protein tái tổ hợp PI-QT ở trạng thái tan cao nhất. Tinh sạch protein tái tổ hợp PI-QT trong E. coli và nhận diện bằng khối phổ .6 Thử hoạt tính ức chế của protein tái tổ hợp PI-QT với protease.

Nghiên cứu biển hiện ức chế protease (PIs) trong hệ nấm men Pichia pastoris. Tạo plasmid pPIC9 mang gen PI-QT. Tạo dòng tế bào Pichia pastoris SMD1168 mang gen PI-QT. Biểu hiện gen PI-QT trong nấm men P.

Kết quả thử hoạt tính ức chế của protein PI-QT biểu hiện trong nấm men. Kết quả phát hiện chất ức chế protease bằng điện di trên gel SDS- PAGE có bổ sung cơ chất casein 0,1 %. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện P. Tinh sạch protein PI-QT tái tổ hợp biểu hiện trong nấm men P.

pastoris qua cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharore 4B. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PI-QT. 106 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 112 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ.

113 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 114 v luan an DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitrile Amp Ampicillin BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp, kb, kDa Base pair, Kilo base, Kilo dalton CFU Colony forming units CSDL Cơ sở dữ liệu CTAB Cetyl trimêtylamôni brômua ĐC Đối chứng DN Đà Nẵng DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate đtg Đồng tác giả DTT Dithiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium bromide FA AntiFoam HMA High microbial abundance IAA 3-Indolebutyric acid IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside KH&CN Khoa học và Công nghệ LB: Luria-Bertani LMA Low microbial abundance mRNA Messenger RNA NCBI National Center for Biotechnology Information P. pastoris Pichia pastoris PCR Polymerase Chain Reaction PIs Protein inhibitors QT Quảng Trị vi luan an RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease SCUBA Self contained underwater breathing apparatus SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris-Acetic-EDTA Taq polymerase Polymerase Thermus aquarius TBS Tris-buffered saline TE Tris- EDTA TFA Axit trifluoroacetic TQ Trung Quốc VSV Vi sinh vật vii luan an DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.

Chất ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên…………… 32 Bảng 2. Thành phần của bản gel polyacryamide. Chất lượng của DNA tổng số tách từ các mẫu hải miên biển Quảng trị. Kết quả lắp ráp DNA metagenome của mẫu QT2.

Kết quả dự đoán, cluster genes và kiểm tra tính toàn vẹn của gen (mẫu QT2). Tổng hợp kết quả chú giải chức năng gen (QT2). Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia vesparium QT2 theo giới và ngành. Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia vesparium QT2 đến lớp và bộ.

Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia vesparium QT2 đến họ; chi. Kết quả sàng lọc các gen có hoạt tính protease inhibitor từ CSDL metagenomics QT2 .9 Gen có hoạt tính sinh học mới (so với ở Việt Nam) .10 So sánh hoạt tính ức chế protease của protein PI-QT tinh sạch thu hồi biểu hiện trong P. pastoris SMD1168 và E. 106 viii luan an DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.

Cấu trúc cơ thể hải miên và các mô. Sơ đồ đại diện cho hải miên asconoid. Vai trò của vi sinh vật với hải miên. Ba trạng thái liên kết chung củ VSV và hải miên.

Ba cách truyền và thu nhận VSV để thiết lập và duy trì các cộng đồng VSV liên kết hải miên. Ba chất ức chế protease có sẵn trên thị trường. Một vài họ PPI quan trọng. Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibitor).

Cơ chế ức chế không cạnh tranh kiểu thứ II. Serpin ức chế protease. Cấu trúc vectơ pET-32a(+). Cấu trúc vectơ pPIC9.

Điện di đồ sản phẩm tách DNA của vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị. Điện di đồ trên gel agarose 1 %. Kết quả tinh sạch dữ liệu QT2. Phân bố độ dài contig sau lắp ráp.

Phân bố độ dài gen. Phân loại chức năng gen trên cơ sở dữ liệu COG. Phân nhóm chức năng của enzyme trên cơ sở dữ liệu CAZy. Kết quả phân loại trên cơ sở dữ liệu KEGG.

Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1,8 %. Phân loại vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 theo giới và ngành. Phân loại vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị theo chi. So sánh trình tự axít amin của protein PI-QT với các trình tự tương đồng trên cơ sở dữ liệu NCBI.

Mối phát sinh quan hệ gen của protein PI-QT với các serpin ix luan an khác. (B) Cấu trúc protein của PI-QT đã được dự đoán bằng SWISS-MODEL. (A) –Gel agarose của vectơ cắt bằng EcoRI/NotI, (B) – Gel agarose của plasmid tái tổ hợp ([pET-32a(+)/PI-QT]) được cắt bằng enzyme EcoRI/ NotI. A- Kết quả điện di PAGE 12,6 % kiểm tra E.

coli BL21(DE3)/[pET-32a(+)/PI-QT] biểu hiện ở 37 oC. Kiểm tra trạng thái của protein PI-QT biểu hiện. Protein PI-QT biểu hiện trong E.