Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học và đa dạnh nguồ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ………………………. NGUYỄN THỊ LIỄU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ ĐA DẠNG NGUỒN GEN DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ LOÀI LÁ KIM Ở TÂY NGUYÊN, VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 62440114 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. Đinh Thị Phòng HÀ NỘI - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của GS. Trần Văn Sung và PGS.

Đinh Thị Phòng. Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực, được đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Thị Liễu LỜI CẢM ƠN Luận án được hoàn thành tại phòng Tổng hợp hữu cơ – Viện Hóa học và phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen- Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.

Trần Văn Sung và PGS. Đinh Thị Phòng người thầy, cô đã hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Xin cảm ơn các cô chú, anh chị phòng Tổng hợp Hữu cơ – Viện Hóa học và phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen - Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong thời gian tôi tiến hành thực nghiệm tại đây. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam và Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Xin cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Thủ Đô Hà nội đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi được đi học và có thời gian hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với sự động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Nguyễn Thị Liễu MỤC LỤC MỞ ĐẦU. Tổng quan về 3 loài lá kim nghiên cứu.

Đặc điểm thực vật và tình trạng bảo tồn. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài trong chi Cephalotaxus, Dacrydium và Nageia. Ứng dụng kĩ thuật phân tích ISSR và SSR trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật. Kỹ thuật ISSR ( Inter Simple Sequence Repeat ).

Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat). Một số thành tựu về nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền của một số loài thuộc chi Cephalotaxus, Dacrydium và Nageia. Nguyên liệu thực vật. Nghiên cứu thành phần hóa học.

Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền. Hóa chất và thiết bị. Nghiên cứu thành phần hóa học. Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền.

Chiết tách các chất từ 3 loài lá kim nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phân lập, tinh chế các chất từ 3 loài lá kim. Hoạt tính sinh học.

Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào [63-67]. Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền. Các cặp mồi ISSR và SSR.

Phương pháp nghiên cứu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Hoạt tính sinh học của các dịch chiết.

Xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch tách được từ 3 loài lá kim. Hoạt tính sinh học của các chất sạch phân lập từ 3 loài lá kim. Đa dạng di truyền nguồn gen của ba loài lá kim nghiên cứu. Đa dạng di truyền.

Cây phát sinh chủng loại của 3 loài lá kim. 126 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 132 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN. 135 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.

136 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 137 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 Proton Nuclear Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR MagneticResonance Spectrocopy proton 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR Resonance Spectrocopy carbon Distortionless Enhancement by DEPT Phổ DEPT Polarisation Transfer Heteronuclear MultipleBond HMBC Phổ HMBC Coherence Heteronuclear SingleQuantum HSQC Phổ HSQC Coherence COSY Correlation Spectrocopy Phổ tương tác proton MS Mass Spectrocopy Phổ khối lượng Electron Spray IonizationMass Phổ khối ion hóa bằng phun mù ESI-MS Spectrocopy điện tử High Resolution ElectronSpray Phổ khối phân giải cao ion hóa HR-ESI-MS Ionization- Mass Spectrocopy bằng phun mù điện tử Nuclear Overhauser Effect NOESY Phổ NOSEY Spectrocopy ISSR Inter Simple Sequence Repeat Lặp lại trình tự đơn giản ở giữa IR Infrared Spectrocopy Phổ hồng ngoại Nồng độ ức chế có hiệu lực 50% IC50 Inhibitory concentration 50% cá thể ED50 Effective dose Nồng độ có hiệu quả 50% cá thể KB Human epidermic carcinoma Ung thư biểu mô HepG2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người Lu-1 Human lung carcinoma Ung thư phổi MCF-7 Human breast carcinoma Ung thư vú SW626 Human ovarian adenocarcinoma Ung thư buồng trứng SW480 Human colon adenocarcinoma Ung thư đại tràng ở người HL-60 Human promyeloccytic leukemia Ung bạch cầu cấp tính SK-Mel2 Human malignant melanoma Ung thư hắc tố P388 Ung thư bạch cầu ở chuột HT-29 Ung thư tuyến giáp ở nam giới COLO-205 Ung thư ruột kết CTPT Công thức phân tử STT Số thứ tự ISSR Inter Simple Sequence Repeat Lặp lại trình tự đơn giản ở giữa Lặp lại trình tự nucleotide đơn SSR Simple Sequence Repeat giản TLTK Tài liệu tham khảo EtOAc Ethyl acetat MeOH Methanol DMSO Dimethylsunfoxid Polymorphic Information PIC Hàm lượng thông tin đa hình Content DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase VU Vulnerable Sẽ nguy cấp NT Near threatened Sắp bị đe dọa d Doublet Đôi s Singlet Đơn m Multiplet Phức hợp br Broad Rộng J (Hz) Hằng số tương tác Độ chuyển dịch hóa học tính δ (ppm) chemical shift in parts per million bằng phần triệu RP18 Silica gel pha đảo RP-18 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Các loài thực vật thuộc chi Cephalotaxus. Các loài thực vật thuộc chi Dacrydium.

Các kiểu khung carbon của các hợp chất alkaloid được phân lập từ chi Cephalotaxus. Các alkaloid khung homoerythrine phân lập từ một số loài thuộc chi Cephalotaxus. Bảng giá trị IC50 thử hoạt tính gây độc tế bào đối với 2 dòng tế bào L1210 và KB của các alkaloid phân lập từ lá của loài C. Nguồn gốc và ký hiệu của các mẫu thuộc 3 loài lá kim dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen.

Hàm lượng % các cao chiết so với mẫu khô cây Hoàng đàn giả. Hàm lượng % các cao chiết so với mẫu khô cây Kim giao núi đất. Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của các dịch chiết từ loài Kim giao núi đất. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết HTE tổng và dịch chiết HĐE với 4 dòng tế bào ung thư.

Dữ liệu phổ H-NMR và C-NMR của hợp chất DT1 và Cephalotaxine. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của DT2 và Cephalotaxine-- N-oxide. Dữ liệu phổ H-NMR và C-NMR của DT3 và Deoxyharringtonine. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của DT4 và Nordeoxyharringtonine.

Dữ liệu phổ 1H NMR và 13C NMR của DT5. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của các chất DT6, DT7 và 3- epi-schellhammericine. Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất DT8 và Harringtonolide. Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của HĐ1và Lambertic acid.

Dữ liệu phổ NMR của HĐ2, Salvinolone [106] và Montbretol. Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13CNMR, HMBC, NOESY của HĐ2 đo trong CDCl3. Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của HĐ4 và Ponasterone A. Dữ liệu phổ H và C-NMR của hợp chất HĐ5 và 20- hyđroxyecdysone.

Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của HĐ6 và ajugasterone C. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của KG1 và Amentoflavone. Số liệu phổ 1H NMR và 13C NMR của các chất KG1, KG2, KG3. Dữ liệu phổ NMR của KG4 và 3β-hydroxytotarol.

Dữ liệu phổ NMR của KG5 và totarol-19-carboxylic acid. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của KG6 và Ferruginol. Dữ liệu phổ NMR của KG7 và Sugiol. Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của chất DT4.

Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của các chất sạch phân lập từ loài Kim giao núi đất. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của DT4 với 4 dòng tế bào ung thư. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập từ loài Hoàng đàn giả. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất KG1, KG4, KG5, KG8 và KG9.

Tổng kết các hợp chất phân lập được từ 3 loài lá kim nghiên cứu. Một số thông số di truyền của 3 loài lá kim phân tích tổ hợp với hai chỉ thị ISSR và SSR. 126 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cây Đỉnh tùng (C.

mannii) Tà Nung, Lâm Đồng và mẫu tiêu bản. Cây Hoàng đàn giả (D. elatum) ở Lâm Đồng và mẫu tiêu bản. Cây Kim giao núi đất (N.

wallichiana) ở Lâm Đồng và mẫu tiêu bản. Các hợp chất cephalotaxine không có mạch nhánh tại C-3. Các hợp chất harringtonine phân lập từ chi Cephalotaxus. Các hợp chất alkaloid khung Drupacine phân lập từ chi Cephalotaxus.

Cấu trúc các hợp chất homoerythrina alkaloid. Các hợp chất flavonoid phân lập từ một số loài thuộc chi Cephalotaxus. Các hợp chất diterpenoid và norditerpen phân lập từ một số loài thuộc chi Cephalotaxus. Cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ loài C.

Các hợp chất từ một số loài thuộc chi Dacrydium. Kỹ thuật ISSR và SSR [53]. Sơ đồ chiết alkaloid tổng từ lá và cành của Đỉnh tùng. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn alkaloid tổng của lá và cành Đỉnh tùng.

Sơ đồ phân lập các chất từ vỏ Đỉnh tùng. Sơ đồ chiết từ mẫu thân và cành Hoàng đàn giả. Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết EtOAc mẫu thân và cành Hoàng đàn giả. Sơ đồ chiết từ mẫu lá và cành Kim giao núi đất.

Sơ đồ phân lập các chất từ cao chiết n-hexane lá và cành Kim giao núi đất. Sơ đồ phân lập các chất từ cao chiết MeOH lá và cành Kim giao núi đất. Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết EtOAc lá và cành Kim giao núi đất. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT1.

Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất DT1. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT2. Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất DT2. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất DT3.

Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất DT3. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT4. Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất DT4. Phổ khối phân giải cao HR- ESI- MS của DT5.

Phổ 1H-NMR của DT5.