Luận án tiến sĩ nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex pcr xác định nhanh đồng

1 MỞ ĐẦU Bacillus anthracis và Yersinia pestis là hai loài vi khuẩn gây bệnh tối nguy hiểm tương ứng là bệnh than và dịch hạch, từng gây nên nỗi kinh hoàng trong lịch sử loài người, có thể bị lợi dụng làm vũ khí sinh học. Bởi tính chất dễ lây truyền và tỷ lệ tử vong cao qua đường hô hấp, theo Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (Centers for Disease Control and Prevention, USA - CDC), B. pestis được phân loại là những tác nhân khủng bố sinh học nhóm A (nhóm các tác nhân sinh học tối nguy hiểm). anthracis còn xuất hiện rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc, trong khi Y.

pestis vẫn tồn tại trên một số loài gặm nhấm ở khu vực Tây Nguyên và có thể bùng phát thành dịch bất kỳ lúc nào. Mặt khác, chúng ta cần có phương án ứng phó nhanh, kịp thời trong phòng chống khủng bố sinh học. Trong một vụ tấn công nghi ngờ có khủng bố sinh học hay mẫu môi trường nghi nhiễm các mầm bệnh này, việc phát hiện nhanh, chính xác tác nhân sinh học là một trong những yếu tố quyết định đến sức khỏe cộng đồng và an ninh quốc gia. Việc sàng lọc nhanh những mẫu nghi ngờ giúp kiểm soát sự lây lan và đảm bảo điều trị chính xác.

Phương pháp nuôi cấy truyền thống được xem là “tiêu chẩn vàng” trong xác định B. Tuy nhiên, mặc dù có độ nhạy cao, phương pháp này đòi hỏi thời gian 2 - 3 ngày, một số trường hợp độ đặc hiệu không cao, cần tiến hành các thử nghiệm bổ sung. Ngoài ra, phương pháp nuôi cấy cần tiến hành ở điều kiện phòng an toàn sinh học cấp 3 (Biosafety level 3, BSL-3) với nhân viên được đào tạo và có kinh nghiệm. Các phương pháp miễn dịch được nghiên cứu dưới dạng các que thử nhanh rất thuận tiện nhưng độ nhạy, độ đặc hiệu thấp.

Do đó, các phương pháp này khó ứng dụng trong chẩn đoán trên thực địa và phòng chống khủng bố sinh học. Hiện nay, đã có một số kỹ thuật dựa trên PCR dùng để xác định nhanh và chính xác B. anthracis cũng như Y. pestis được phát triển với những ưu điểm nổi bật như độ nhạy, độ đặc hiệu cao và có thể thực hiện với các mẫu đã bất hoạt (nên chỉ 2 cần thực hiện ở điều kiện phòng an toàn sinh học cấp 2).

Tuy nhiên, hầu hết các kỹ thuật này chỉ phát hiện một loại plasmid độc lực với từng tác nhân nên không phát hiện được các trường hợp chủng thiếu một trong các plasmid trên. anthracis trong tự nhiên, để chẩn đoán chính xác những chủng gây bệnh, ngoài gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể, cần chỉ ra được sự có mặt đầy đủ của hai plasmid độc lực là pXO1 và pXO2. Trong thực tế có những chủng B. anthracis thiếu một trong hai plasmid trên nên khả năng gây bệnh thay đổi.

pestis chứa hai plasmid liên quan đến tính độc là pPCP1 và pMT1 với các gen đặc trưng tương ứng. Do đó, các kỹ thuật này có thể không đánh giá được đầy đủ tình trạng độc lực của B. pestis và phải phụ thuộc vào thiết bị chuyên dụng đắt tiền nhưng vẫn có thể bỏ sót chẩn đoán, chưa đề cập đến là chúng có thể không phù hợp với một số chủng trong nước. Ở Việt Nam, việc sử dụng các kỹ thuật dựa trên PCR để chẩn đoán B.

pestis đã được một số tác giả công bố, tuy nhiên những nghiên cứu này chỉ mới dừng ở việc thiết kế kỹ thuật PCR để chẩn đoán từng loại vi khuẩn trên. Điều này có nghĩa là trong thực tế khi bệnh dịch xảy ra mà chưa biết tác nhân nào được sử dụng, nếu dùng PCR với tác nhân thứ nhất cho kết quả âm tính thì phải dùng PCR lần thứ hai với tác nhân khác, như vậy đòi hỏi thời gian và kinh phí. Do đó, kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR - mPCR) có thể xác định chính xác đồng thời hai loại tác nhân B. pestis là một lựa chọn khả thi.

Xuất phát từ những vấn đề trên, luận án: “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis” được thực hiện với hai mục tiêu: - Phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời B. - Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật multiplex PCR trên các bộ mẫu chuẩn và các chủng phân lập. 3 Đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời B. Kỹ thuật multiplex PCR với 6 cặp mồi được thiết kế, tối ưu cho phép khuếch đại đồng thời 7 sản phẩm bao gồm: 3 gen đích là vrrA (thuộc nhiễm sắc thể), pagA (thuộc plasmid pXO1), capA (thuộc plasmid pXO2) của B.

anthracis; và 3 gen đích là ypo2088 (thuộc nhiễm sắc thể), pla (thuộc plasmid pPCP1), caf1 (thuộc plasmid pMT1) của Y. pestis, cùng 1 gen chứng nội tại là plasmid tái tổ hợp để xác minh kết quả chẩn đoán. Do đó, khắc phục được hiện tượng dương tính giả đối với trường hợp các chủng vi khuẩn B. pestis không đầy đủ độc lực, phân biệt với chủng gây bệnh, giúp giảm giá thành chẩn đoán so với việc phải thực hiện các lần PCR riêng rẽ, rút ngắn thời gian chẩn đoán.

4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN B. Tổng quan về vi khuẩn B. Đặc điểm sinh học B.

anthracis là trực khuẩn thuộc chi Bacillus, họ Bacillaceae. Chi Bacillus gồm các vi khuẩn Gram dương sinh bào tử, đa số không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (Bacillus cereus), một số có lợi cho con người (Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides). Đặc điểm hình thái, tính chất sinh lý, sinh hoá, tính chất nuôi cấy của các loài thuộc chi Bacillus rất giống nhau. anthracis có đặc điểm khác biệt với các loài trực khuẩn hiếu khí sinh bào tử khác, đó là có plasmid pXO1 mã hóa cho ngoại độc tố và plasmid pXO2 mã hoá protein vỏ.

anthracis hình thẳng, hai đầu vuông, kích thước từ 11,51,58 µm, thường xếp thành từng chuỗi dài (Hình 1. Ở ngoại cảnh hoặc trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn hình thành bào tử nằm giữa thân và không làm thay đổi hình dạng tế bào. Trên động vật bị bệnh hoặc môi trường nuôi cấy đặc biệt, vi khuẩn có vỏ, không di động (Lê Thu Hồng, 2011; Christine, 2015). anthracis trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm máu (Nguồn: Christine, 2015) 5 B.

anthracis dễ sinh trưởng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37C, pH 6,9 - 7,0. Trên môi trường thạch thường, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng R (Rough - dạng xù xì), đường kính 4 - 5 mm, màu trắng ngà, bờ không đều, rất dai, bám chặt vào bề mặt môi trường. Trên môi trường thạch máu cừu, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc không làm tan máu, khuẩn lạc khi được phóng đại vài chục lần có hình thể như búi tóc xoăn hoặc bờm sư tử (Hình 1. Vi khuẩn mọc không làm đục trên môi trường lỏng, tạo cặn như bông lắng xuống đáy, lắc không tan.

Tính chất lên men đường của B. anthracis bao gồm: Lên men không sinh hơi với các đường glucose, manitol, saccarose, không lên men đường salicin, làm lỏng gelatin, đông huyết tương, không mọc trên môi trường thạch Mac Conkey (Geo, 2013). anthracis trên môi trường thạch máu cừu (Nguồn: Christine, 2015) Thể sinh dưỡng của B. anthracis có sức đề kháng không cao, bị diệt ở điều kiện nhiệt độ 60°C trong 30 phút, ở 100°C trong 5 phút và những chất khử trùng thông thường.

Thể bào tử có sức đề kháng rất cao, tồn tại trong điều kiện tự nhiên nhiều năm, có thể tới vài chục năm mà vẫn còn khả năng gây bệnh (Geo, 2013). Tuy nhiên, bào tử có thể bị phá hủy bởi hấp ướt ở điều kiện 121°C sau 20 phút (Fasanella, 2003). Độc lực của B. anthracis được tạo thành bởi 2 yếu tố chính đó là ngoại độc tố và protein vỏ.

Ngoại độc tố của B. anthracis hợp thành từ 3 yếu tố riêng biệt được mã hóa bởi plasmid pXO1. Yếu tố gây phù làm ức chế chức năng của bạch cầu đa nhân 6 trung tính, yếu tố bảo vệ giúp độc tố xâm nhập vào tế bào chủ và yếu tố gây chết làm tăng hoạt hóa đại thực bào, hoạt hóa quá trình đốt oxy, giải phóng cytokin, bất hoạt protein kinase (Lê Thu Hồng, 2011; Jang, 2011). Protein vỏ có bản chất là chuỗi trùng hợp axit poly-D-glutamic mà sự tổng hợp của nó liên quan đến sự xuất hiện của plasmid pXO2.

Plasmid này có thể truyền từ loài có khả năng hình thành vỏ sang loài không có khả năng này (Jang, 2011; Lê Thu Hồng, 2011; Christine, 2015). Những chủng không có khả năng hình thành vỏ cũng mất khả năng gây bệnh và thường được dùng để chế tạo vắc xin (Okinaka, 2014). Bản thân protein vỏ không gây độc nhưng có chức năng bảo vệ vi khuẩn do có khả năng chống lại phức hợp bổ thể và hiện tượng thực bào của bạch cầu. Vỏ của vi khuẩn có thể được hình thành ở động vật mắc bệnh hoặc trên môi trường nuôi cấy ở điều kiện khí trường CO2 5%, được phát hiện bằng các phương pháp như: Nhuộm mực tàu, kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang.

Đây cũng là những phương pháp để phân biệt B. thuringiensis bởi chúng đều không có khả năng tổng hợp vỏ. Với những chủng B. anthracis không có plasmid pXO2, thành tế bào xuất hiện lớp S-layer (Surface layer), gồm 2 loại protein là EA1 (Extractable Antigen 1- Kháng nguyên có thể tách chiết) và Sap (Surface array protein- Protein bề mặt), được mã hóa bởi các gen trên nhiễm sắc thể.

Đây là một dạng siêu cấu trúc xuất hiện phổ biến ở một số đơn bào nguyên thủy và các vi khuẩn khác. Lớp S-layer được cho là có vai trò quan trọng trong mối liên hệ giữa vi khuẩn và môi trường bên ngoài, đảm bảo hình dạng vi khuẩn và là nơi gắn kết của các phage. Ngoài ra, S-layer còn có vai trò giúp vi khuẩn chống lại tác động của bổ thể và thay đổi khả năng tiếp cận của đại thực bào vật chủ (Fouet, 1999). Đặc điểm hệ gen Hệ gen của B.

anthracis gồm 1 nhiễm sắc thể dạng vòng và 2 plasmid độc lực là pXO1, pXO2. Hệ gen với hàm lượng nucleotide AT cao, GC chỉ chiếm khoảng 35%. Điều này cho thấy DNA của B. anthracis có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn các loài khác.

Các plasmid tương đối lớn và mã hóa cho nhiều gen khác nhau, 7 nhưng quan trọng nhất là các gen mã hóa cho ngoại độc tố và protein vỏ. Plasmid pXO1 chứa các gen độc tố quan trọng là pagA, lef và cyaA.