Luận án nghiên cứu phối hợp esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm

MỞ ĐẦU Hiện nay, nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan giải của bất kì quốc gia nào trên thế giới. Trong số các nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ đang sử dụng hiện nay (năng lượng gió, mặt trời, hạt nhân,…), năng lượng sinh học đang là xu thế phát triển tất yếu, nhất là ở các nước nông nghiệp và nhập khẩu nhiên liệu. Dựa vào nguyên liệu sản xuất, người ta chia NLSH thành 4 thế hệ: Thế hệ I (từ tinh bột như ngô, sắn, mía đường), thế hệ II (từ sinh khối thực vật như thân cây lúa, ngô, lúa mỳ, bã mía), thế hệ thứ III (từ các loài vi tảo) và thế hệ IV - nhiên liệu tiên tiến (dựa trên các chuyển hóa sinh - hóa, nhiệt – hóa). Chúng phân thành ba nhóm là dầu sinh học (biodiesel), khí sinh học (biogas) và bioethanol (ethanol sinh học).

Trong đó, bioethanol đang rất được quan tâm do từ ngày 01/01/2018 chính phủ ban hành quyết định sử dụng xăng sinh học E5 (5% bioethanol) thay thế xăng RON 92 trên toàn quốc. Do vậy, nhu cầu sản xuất và tiêu thụ bioethanol ngày càng tăng cao. Việc sản xuất nhiên liệu sinh học nói chung và bioethanol theo thế hệ I từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) và đường (mía) rất phổ biến. Bên cạnh đó, bioethanol còn được sản xuất từ lignocellulose theo thế hệ thứ II.

Nguồn nguyên liệu này chủ yếu bao gồm: gỗ, rơm lúa, bã mía, thân cây ngô…là các sinh khối có thành phần lignocellulose phổ biến nhất trong số các phụ phẩm công-nông nghiệp. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này sử dụng chưa hiệu quả mà chủ yếu theo phương pháp truyền thống như làm cơ chất nuôi nấm, thức ăn gia súc, ủ làm phân bón, đốt. Do vậy, việc tận dụng nguồn cơ chất này để sản xuất bioethanol là một giải pháp thích hợp, đặc biệt là với các quốc gia với nền nông nghiệp như Việt Nam. Mặc dù nguồn nguyên liệu giàu lignocellulose rất phổ biến nhưng những khó khăn để có thể tận dụng hiệu quả nguồn sinh khối này cho sản xuất các sản phẩm có giá trị cao hơn chủ yếu do lignocellulose có cấu trúc phức tạp, khó chuyển hóa sinh học.

Việc sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối phụ phẩm công - nông nghiệp một mặt tận dụng nguồn nguyên liệu rồi rào thay thế nguồn nguyên liệu truyền thống, mặt khác tạo thành nguồn năng lượng sạch giúp giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do đốt hoặc xử lý theo phương pháp truyền thống gây ra, đồng thời không ảnh hưởng tới an ninh 1 lượng thực quốc gia. Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt trong công nghệ lên men sản xuất bioethanol thế hệ II. Theo phương thức truyền thống có thể sử dụng phương pháp hóa học (axít/bazơ) hoặc hóa lý (nghiền/nổ hơi). Tuy nhiên, một trong những hướng đi mới để giải quyết nhiệm vụ này là sử dụng xúc tác sinh học (enzyme từ các loài nấm), chúng được biết là có hệ enzyme xúc tác hiệu quả giúp chúng phân hủy tốt lignocellulose để giải phóng các đơn vị đường cần thiết cho quá trình lên men bioethanol.

Nhìn chung các enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp trên cơ chất thô và việc xúc tác chuyển hóa hiệu quả cơ chất cần kết hợp nhiều enzyme có tác dụng hiệp đồng. Do vậy, mục đích của đề tài luận án “Nghiên cứu phối hợp esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm công-nông nghiệp để thu nhận bioethanol” nhằm sử dụng hỗn hợp các enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme esterase (acetyl esterase và feruloyl esterase), enzyme thủy phân và/hoặc oxy hóa từ nấm để phân hủy các cấu trúc polymer phức tạp để lên men thu nhận bioethanol. Mục tiêu nghiên cứu: Hiên nay, khả năng chuyển hóa các vật liệu thô từ sinh khối giàu lignocellulose bằng các phương pháp truyền thống còn nhiều mặt hạn chế. Do vậy, mục tiêu của đề tài luận án nhằm khai thác nguồn đa dạng xúc tác sinh học (enzyme thủy phân) từ nấm để chuyển hóa hiệu quả sinh khối giàu lignocellulose từ các phụ phẩm công-nông nghiệp thành các đường (C5 và C6) có khả năng lên men cho sản xuất bioethanol.

Đặc biệt, luận án sử dụng “enzyme cocktail” xúc tác hiệp đồng để tăng khả năng chuyển hóa sinh học. Trong đó, nghiên cứu sử dụng carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)] nhằm phối hợp với các enzyme tấn công mạch chính (cellulase/xylanase) và mạch nhánh để thủy phân cấu trúc lignocellulose. Mục tiêu tiếp theo là đánh giá khả năng lên men nguồn dịch đường sau thủy phân bằng “enzyme cocktail” thành bioethanol. Nội dung nghiên cứu: Để đạt được mục tiêu trên, các nội dung nghiên cứu chính đã thực hiện: - Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp enzyme carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)]; 2 - Sinh tổng hợp và tinh sạch protein enzyme hoạt tính FAE và AE từ môi trường nuôi cấy nấm và xác định đặc tính của enzyme tinh sạch.

- Chuyển hóa vật liệu lignocellulose thành các đường đơn (hexose và pentose) có khả năng lên men sử dụng đơn enzyme và “enzyme cocktail” hoạt tính cellulase/xylanase và esterase xúc tác hiệp đồng. - Tối ưu quy trình chuyển hóa và nghiên cứu sản xuất bioethanol từ dịch đường chuyển hóa quy mô phòng thí nghiệm. Những đóng góp mới của luận án: - 44 chủng nấm thuộc 13 họ thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) và nấm Đảm (Basidiomycota) được phân lập và sàng lọc khả năng sinh tổng hợp carbohydrate esterase (feruloyl esterase và acetyl esterase). - Lần đầu tiên, enzyme feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima và acetyl esterase từ nấm Xylaria polymorpha được phân lập và tinh sạch từ môi trường nuôi cấy giàu lignocellulose.

Trong đó, feruloyl esterase từ Alt. tenuissima (AltFAE) có trọng lượng phân tử Mw = 30,3 kDa với hoạt tính đặc hiệu 11,2 U/mg. Acetyl esterase từ X. polymorpha (XpoAE) có trọng lượng phân tử Mw = 44 kDa với hoạt tính đặc hiệu 13,1 U/mg.

Hai enzyme này có độ bền cao trong khoảng nhiệt độ 40 đến 450C và pH 5,0. - Enzyme carbohydrate esterases tinh sạch kết hợp với enzyme thương mại (hỗn hợp “enzyme cocktail” hoạt tính cellulase/xylanse (cell/xyl)) được tối ưu thành phần và sử dụng để chuyển hóa sinh khối thực vật thô (vd. mía bã mía, rơm rạ, bột gỗ, rong túi…) thành các đường đơn có khả năng lên men bioethanol. Trong đó, bã mía được chọn làm cơ chất phù hợp để sản xuất các đường C5/C6 (vd: glucose, xylose).

- Bằng quy hoạch thực nghiệm đã xác định điều kiện tối ưu cho chuyển hóa bã mía bằng “enzyme cocktail” là ở 400C, pH 5.0, trong 48 giờ và hoạt độ enzyme là cell/xyl: 100 U/g, AltFAE: 7,56 U/g, XpoAE: 10,8 U/g sinh khối khô. Khi đó, tổng các đường lên men là 251,86 mg/g. Kết hợp xử lý bã mía bằng “enzyme cocktail” và axit H2SO4 loãng (0,1%) thì các đường lên men sinh ra là 319,5 mg/g, đạt hiệu suất 49,8%. 3 - Các đường đơn thu được bằng chuyển hóa enzyme đã được chứng minh có khả năng lên men bioethanol (cồn sinh học) bởi chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae với hàm bioethanol thu được 178ml/kg bã mía, đạt hiệu suất 79,8% so với lý thuyết.

Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án: Bên cạnh sản xuất bioethanol từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) và đường (mía), bioethanol có thể được sản xuất từ lignocellulose. Lignocellulose là loại sinh khối (biomass) phổ biến nhất trong sinh quyển. Sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối là một giải pháp thích hợp, đặc biệt là với các quốc gia với nền nông nghiệp như Việt Nam. Hàng năm sản xuất công-nông nghiệp trong nước sản sinh hàng trăm triệu tấn phụ phẩm giàu lignocellulose là nguồn cung cấp nguyên liệu vô cùng dồi dào cho sản xuất năng lượng sạch, mặt khác giải quyết vấn đề ô môi trường do không được xử lý hay loại bỏ theo phương pháp truyền thống.

Theo các tài liệu công bố và kinh nghiệm nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, nhìn chung các enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp (không qua tiền xử lý) trên cơ chất thô. Điều này có thể khắc phục bằng việc sử dụng hỗn hợp các enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme thủy phân và/hoặc oxy hóa để phân hủy các cấu trúc polymer phức tạp. Ngoài ra, sàng lọc enzyme bằng nuôi cấy vi sinh vật có vai trò quan trọng trong việc tìm ra các enzyme mới với hoạt tính xúc tác thủy phân cao và các đặc tính hữu ích. Đề tài luận án không nhằm giải quyết được toàn bộ các bước từ chuyển hóa vật liệu sinh khối thô thành bioethanol mà mục tiêu chính nhằm khai thác và sử dụng nguồn xúc tác sinh học từ nấm và tối ưu hóa cho chuyển hóa sinh khối thành đường có khả năng lên men.

Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt trong công nghệ lên men sản xuất bioethanol thế hệ II. 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose 1. Nguồn gốc và thành phần Phụ phẩm công-nông nghiệp là một dạng sinh khối có thành phần lignocellulose phổ biến nhất trong số các phụ phẩm công-nông nghiệp của Việt Nam.

Hiện nay, mỗi năm nguồn sinh khối này sản sinh ra hàng trăm triệu tấn từ quá trình sản xuất công-nông nghiệp như: rơm rạ, bã cà phê, mùn gỗ, thân cây ngô, vỏ trấu và hàng chục triệu tấn bã mía thường được sử dụng để đun nấu (lãng phí nhiệt trên 80%), cơ chất để trồng nấm, thức ăn gia súc và phần lớn được đốt bỏ thu tro làm phân bón [1]. Việc đốt này gây ra hiện tượng sương mù quang hóa rất độc hại là nguyên nhân gây nên một số bệnh về mắt, phổi. Nguy hiểm hơn, chúng gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng ở vùng ven các thành phố lớn và dọc các đường cao tốc làm giảm tầm nhìn dễ dẫn đến tai nạn giao thông. Đặc biệt, gây lãng phí lượng lớn chất hữu cơ có giá trị, trong khi đó nếu khai thác sử dụng hợp lý thì nguồn sinh khối này đem lại lợi ích vô cùng lớn [2,3].

Lignocellulose ngày càng có vai trò quan trọng về mặt kinh tế khi được sử dụng như vật liệu thô cho các ứng dụng trong công nghệ sinh học và công nghiệp, hơn nữa chúng chính là cơ sở để thúc đẩy việc nghiên cứu tận dụng sinh khối trong các mô hình sản xuất tinh chế và chiến lược cho sự phát triển bền vững [4]. Các polymer sinh học này có thể thấy ở tất cả các hệ sinh thái trên đất liền và đây là nguồn hợp chất hữu cơ tái tạo lớn nhất trong sinh quyển.