Luận án tiến sĩ tách chiết, tinh sạch và ứng dụng hợp chất sinh học từ nấm vân chi Coriolopsis aspera - Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM NGUYỄN NGỌC THUẦN TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ ỨNG DỤNG HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ NẤM VÂN CHI (Coriolopsis aspera) Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 9.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cán bộ hướng dẫn: PGS. Đàm Sao Mai PGS. Lê Trung Thiên TP.HCM – Năm 2022 1 luan an LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS. Đàm Sao Mai và PGS.

Lê Trung Thiên. Các số liệu, kết quả trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Nguyễn Ngọc Thuần ii luan an LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài “Tách chiết, tinh sạch và ứng dụng hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm vân chi Coriolopsis aspera”, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện của tập thể lãnh đạo, các nhà khoa học, cán bộ, giảng viên, chuyên viên Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM; tập thể Ban Ban Giám hiệu, Ban lãnh đạo - Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM; tập thể Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, cán bộ các phòng, ban chức năng Trường Đại học Nông Lâm TP. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành về sự giúp đỡ đó.

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô PGS. TS Đàm Sao Mai và thầy PGS. TS Lê Trung Thiên. Cô và thầy đã truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức, nhiều kinh nghiệm và đặc biệt có những ý kiến đóng góp, trao đổi thật sự bổ ích, thiết thực về luận án tiến sĩ của tôi.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bạn bè, đồng nghiệp của tôi đang công tác tại Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM và gia đình đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này. Nghiên cứu sinh iii luan an TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm tìm ra điều kiện trích ly, tinh sạch các thành phần trong dịch cao chiết từ nấm Coriolopsis aspera để định danh và làm giàu các chất có hoạt tính sinh học trong dịch trích ly từ nấm. Từ đó nghiên cứu ứng dụng tạo sản phẩm bột hòa tan từ dịch trích ly được làm giàu các chất có hoạt tính sinh học theo hướng có lợi cho sức khỏe. Luận án bao gồm 4 nội dung: Nội dung đầu tiên là khảo sát 5 phương pháp xử lý nguyên liệu như phương pháp siêu âm, vi sóng, đun nước nóng, kết hợp hóa học và siêu âm, kết hợp nitơ lỏng và siêu âm.

Kết quả đạt được phương pháp kết hợp nitơ lỏng và siêu âm trích ly thu được thành phần TPC, TFC, TTC cao. Tiếp theo là khảo sát ảnh hưởng 3 loại dung môi như aceton, methanol, ethanol đến hàm lượng TPC, TFC, TTC và RSA. Kết quả thu được dung môi ethanol và methanol 80% trích ly được hàm lượng TPC, TFC, TTC và RSA cao. Do dung môi ethanol phù hợp trong chế biến thực phẩm nên đã được lựa chọn để tiến hành thực hiện tối ưu hóa điều kiện trích ly.

Kết quả tối ưu hóa theo phương pháp đáp ứng bề mặt với mô hình Box-Behnken thu được thông số nhiệt độ trích ly 40oC, tỷ lệ dung môi ethanol với nguyên liệu 53:1, thời gian trích ly 8,04 giờ, nồng độ ethanol 79,6% thì cho hàm mục tiêu tương ứng TPC 7,8407 mg GAE/g DW, TFC 1,3307 mgQE/g DW, TTC 2,0843 mgOAE/g DW, RSA 4,5940 µgVitC/g DW. Nội dung tiếp theo là định tính nhóm chất có hoạt tính sinh học của dịch cao CoAEO theo phương pháp thay đổi màu sắc và hiện tượng của dịch cao CoAEO sau khi cho thuốc thử. Kết quả thu được các chất chuyển hóa bậc 2 nhiều như nhóm chất phenolic, tannin, alkaloid, terpenoid, và steroid. Còn nhóm chất flavonoid và saponin ở mức trung bình, chỉ có nhóm chất coumarin ít.

Cuối cùng là tinh sạch để xác định chất trong dịch cao CoAEO. Kết quả đã tinh sạch được 9 chất sạch, trong đó từ cao chiết ethyl acetate thu được 4 hợp chất là trametenolic B, cerevisterol, ergosterol, ergosterol peroxit và từ cao nước thu được 5 hợp chất như trans- p-hydroxycoumaric acid, methyl ferulat, methyl (2-hidroxyphenyl) acetat, umbelliferone, 8-hydroxy-3,4- dimethylisocoumarin. Nội dung thứ 3 là thử hoạt tính chống oxy hóa của dịch cao CoAEO theo phương pháp DPPH. Kế quả đã đo được IC50 (mg/l) bằng 0,064 với chứng (+) là axít ascorbic bằng iv luan an 0,035 mg/ml.

Tiếp theo là thử khả năng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) của cao CoAEO theo phương pháp MTT. Kết quả thu được IC50 bằng 98,3µg/ml với chứng (-) DMSO bằng 0 và chứng (+) là Ellipticine bằng 3,63 (µg/ml) và tế bào ung thư gan (Hep-G2) được đo theo IC50 bằng 88,6 (µg/ml) với chứng (-) DMSO bằng 0 và chứng (+) là Ellipticine bằng 3,98 (µg/ml). Kế tiếp là thử khả năng kháng VSV của cao CoAEO theo phương pháp đổ đĩa thạch và đo đường kính vòng tròn kháng khuẩn. Kết quả thu được cao CoAEO có khả năng kháng trên 5 chủng VSV như V.

Sau cùng là thử độc tính cấp và bán trường diễn của dịch cao CoAEO trên chuột theo phương pháp Lorke và theo hướng dẫn 407 (2001) của tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) về thử nghiệm hóa chất. Thí nghiệm độc tính cấp cho chuột uống dịch cao chiết CoAEO ở mức liều cao (0, 2000, 4000 và 6000 mg /kg thể trọng) trong 14 ngày kết quả không thấy chuột chết trên các lô thí nghiệm, còn thí nghiệm độc tính bán trường diễn cho chuột uống dịch cao chiết CoAEO ở mức liều (100, 200, 300 và 400mg/kg) trong 90 ngày kết quả không thấy dấu hiệu bất thường trên các lô thí nghiệm. Điều đó có thể kết luận rằng với hàm lượng TTC trong dịch cao 781,8 mg oleanolic/kg thể trọng và 52,12 mg oleanolic/ kg thì không gây độc trên chuột. Nội dung cuối cùng là khảo sát lựa chọn tỷ lệ hỗn hợp chất mang bao gồm maltodextrin:gum arabic:gelatin.

Kết quả thu được ở tỷ lệ 94:5:1 phù hợp để nghiên cứu tối ưu hóa trong công đoạn sấy phun. Thực hiện tối ưu hóa trong công đoạn sấy phun theo phương pháp đáp ứng bề mặt với mô hình Box-Behnken. Kết quả thu được thông số dự đoán như nhiệt độ sấy đầu vào 133oC, hàm lượng chất mang 16% (w/w), lưu lượng nạp liệu 22,5ml/phút khi đó phần mềm cho kết quả dự đoán các hàm mục tiêu lần lượt là hiệu suất thu hồi bột 42,201%, độ ẩm bột 2,936% và độ giảm chống oxy hóa khả 9,224%, độ giảm TFC 2,358%, độ giảm TPC 4,124%, độ giảm TTC 0,909%. Kết quả kiểm chứng đối với các hàm mục tiêu hoàn toàn giống với kết quả dự đoán.

Cuối cùng nghiên cứu thời gian bảo quản bột theo phương pháp Q10. Kết quả thu được thời gian bảo quản sản phẩm bột CoAEO hòa tan ở nhiệt độ mát 20oC (khả năng chống oxy hóa giảm 20% so với ban đầu) sẽ là: 45,2 ngày tương tự thời gian bảo quản v luan an ở nhiệt độ mát 20oC (hàm lượng triterpene tổng giảm 20% so với ban đầu) sẽ là: 69,5 ngày. Tính toán về độ an toàn sinh học trên 100g sản phẩm bột CoAEO hòa tan dựa trên kết quả thực nghiệm độc tính cấp và bán trường diễn. Kết quả cho thấy hàm lượng TTC (mg oleanolic) nằm dưới mức 781,8 mg oleanolic/kg thể trọng và 52,12 mg oleanolic/ kg.

Từ khóa: Cao chiết CoAEO, Coriolopsis aspera, nấm vân chi, tách chiết, tinh sạch. vi luan an ABSTRACT The study aimed to investigate the extraction and purification conditions of the components in the extract from the fungus Coriolopsis aspera to identify and enrich the biologically active substances in mushroom extract. Accordingly, the study on production of soluble healthy products from the extracts enriched with biologically active substances was conducted. The thesis consists of 4 topics: The first content was to investigate five methods of raw material processing, including the methods using ultrasonic, microwave, hot water, combination of chemical and ultrasonic combination and combination of liquid nitrogen and ultrasound.

High contents of TPC, TFC, TTC was obtained from the extraction method of combining liquid nitrogen and ultrasonic. Subsequently, the influence of solvents such as acetone, methanol, ethanol on the contents of TPC, TFC, TTC and RSA was carried out. And as a result, 80% ethanol and methanol were the solvents help efficiently extract the components when high amounts of TPC, TFC, TTC and RSA were obtained. However, only Ethanol was chosen to optimize the extraction conditions due to its suitability for food processing.

Optimization conditions obtained using surface response method with Box-Behnken model included the extraction temperature of 400C, ratio of ethanol to raw materials of 53:1, the extraction time of 8.04 hours and the ethanol concentration of 79.6% with the corresponding objective functions of TPC 7.8407 mg GAE/g DW, TFC 1.3307 mgQE/g DW, TTC 2.0843 mgOAE/g DW, RSA 4. The next content was the qualification study on the biologically active substances in the CoAEO extract using the method of color change and phenomenon of CoAEO solution after adding the reagent. As a result, a large number of secondary metabolites such as phenolic compounds, tannins, alkaloids, terpenoids, and steroids were obtained. And the amounts of flavonoids and saponins were moderate while that of coumarins was low.

Finally, the extract was subject to purification to determine the substances present in the CoAEO extract. As a result, 9 substances were purified, of which 4 compounds were obtained from ethyl acetate extract (trametenolic B, cerevisterol, ergosterol, ergosterol peroxide) and 5 compounds were from the aqueous vii luan an extract (trans-p-hydroxycoumaric acid, methyl ferulat, methyl (2-hydroxyphenyl) acetate, umbelliferone, 8-hydroxy-3,4-dimethylisocoumarin). The third content was to characterize the CoAEO extract in terms of certain bioactivities, including antioxidant, anticancer and antibacterial activities. The antioxidant activities were evaluated based on free radical scavenging capacity with the IC50 value 0.

Notably, the CoAEO extract was demonstrated to be able to inhibit cervical cancer cells (HeLa) with the IC50 value of 98.3 µg/ml compared to 3,63 (µg/ml) of the positive control (+) (Ellipticine) and liver cancer cells (Hep-G2) with IC50 values of 88. In addition, the CoAEO extract was also resistant against five strains of microorganisms, including V. ceråeus ATCC 11778, S. faecalis ATCC 29212 with inhibition zone diameters of 0.

To ensure the safety of the extract, the acute and sub-chronic toxicity tests were performed using Lorke method and the guideline 407 (2001) on chemical testing of the Organization for Economic Co-operation and Development (OECD). The acute toxicity test for rats administered with CoAEO extract at high doses (0, 2000, 4000 and 6000 mg/kg body weight) for 14 days resulted in no death, while sub-chronic toxicity tests of CoAEO extract in rats at doses (100, 200, 300 and 400mg/kg) for 90 days did not show any abnormality. Therefore, it could be concluded that high TTC concentrations of 781.8 mg oleanolic/kg and 52.12 mg oleanolic/kg body weight were not toxic to rats. The last content was to determine to the optimal ratio of carrier mixture of maltodextrin:gum arabic:gelatin.