Luận án: Khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của cây dứa (Ananas comosus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ THU HẬU KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus) LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 7420201 NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ THU HẬU MÃ SỐ NCS: 0917003 KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus) LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 7420201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN PGS. TRẦN NHÂN DŨNG PGS. HUỲNH VĂN BÁ NĂM 2022 Luận án Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập, nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ em đã nhận được sự hướng dẫn, động viên, giúp đỡ của thầy cô, gia đình, bạn bè cả về vật chất lẫn tinh thần. Em xin gửi lời cảm ơn và ghi nhận những sự hỗ trợ, những lời động viên vô cùng quý báu để em có được thành quả như ngày hôm nay.

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học và tất cả thầy, cô trong và ngoài Viện đã tận tình truyền đạt và giúp đỡ em về chuyên môn cũng như những khó khăn khác trong suốt quá trình theo học Nghiên cứu sinh tại Trường Đại học Cần Thơ. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. Trần Nhân Dũng, PGS. Nguyễn Minh Chơn và TS.

Nguyễn Đức Độ là những người thầy đã truyền đạt cho em rất nhiều những kiến thức thực tế về nghiên cứu Khoa học đồng thời các thầy cũng giúp đỡ em tháo gỡ những khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu Luận án. Xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Kiên Giang, quý thầy cô giáo, các bạn đồng nghiệp đã tạo điều kiện tốt nhất về thời gian, tinh thần giúp em hoàn thành Luận án này. Cuối cùng, con xin dành những lời cảm ơn sâu sắc nhất đến bố mẹ và các em. Con cảm ơn bố mẹ đã luôn bên con, che chở, động viên con khi con mệt mỏi và gục ngã.

Con nhớ lắm câu nói của bố: “Thời bố mẹ ngày xưa khổ lắm không có điều kiện đi học, các con bây giờ có điều kiện phải cố gắng…”. Cảm ơn gia đình đã luôn tin tưởng và ủng hộ con trên con đường mà con lựa chọn. Một lần nữa con xin chân thành cảm ơn và xin chúc tất cả những người mà con yêu thương luôn luôn vui vẻ, hạnh phúc và thành công. Kiên Giang, ngày 02 tháng 04 năm 2022 Chuyên ngành Công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Dứa là loại cây ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao thuộc họ Bromeliaceae có nguồn gốc từ Paraguay được trồng phổ biến ở nhiều vùng sinh thái khác nhau ở Việt Nam.

Mục tiêu của luận án là khảo sát khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao chiết từ các bộ phận của cây dứa (lá, thân, thịt quả và vỏ quả) ở Hòn Đất và Tắc Cậu thuộc tỉnh Kiên Giang. Luận án sử dụng phương pháp định danh loài bằng phương pháp phân tích đặc điểm hình thái đồng thời có kiểm định lại bằng phương pháp giải trình tự, trích ly cao bằng phương pháp ngâm dầm kết hợp với đánh sóng siêu âm, khảo sát khả năng kháng oxy hóa in vitro của các mẫu cao chiết được thực hiện thông qua ba phương pháp gồm: phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl); phương pháp khử ion Fe3+ và phương pháp khử ion Cu2+, phương pháp khảo sát ức chế hoạt động enzyme tyrosinase in vitro, phương pháp sắc ký cột silica gel để tách cao phân đoạn vỏ dứa Tắc Cậu. Sử dụng phương pháp nuôi cấy tế bào động vật, khảo sát sự ức chế hình thành melanin trên dòng tế bào hắc tố B16F10 và phân tích phổ GC-MS của cao phân đoạn có hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase mạnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy, vùng sinh thái Tắc Cậu, Kiên Giang và dung môi methanol là thích hợp phục vụ nghiên cứu của luận án.

Dựa vào đặc điểm hình thái và trình tự gen ITS cho thấy dứa thuộc chi Ananas với tên khoa học là (Ananas comosus (L. Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng polyphenol tổng cao nhất trong mẫu chiết xuất methanol lá còn hàm lượng flavonoid tổng cao nhất trong mẫu methanol vỏ dứa. Kết quả kháng oxy hóa từ ba phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa khác nhau cho thấy kết không giống nhau. Khả năng trung hòa DPPH của cao chiết methanol lá mạnh nhất so với các mẫu còn lại, cao chiết lá- methanol có giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) là: 31,27 ± 3,91µg/mL, hoạt tính khử ion Fe3+, khử ion Cu2+ mạnh nhất là chiết xuất vỏ-methanol với chỉ số IC50 lần lượt là: 97,72 ± 0,42; 220,95 ± 8,2.

Khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro cho thấy, chiết xuất vỏ-methanol có hoạt tính mạnh nhất so với các chiết xuất thô còn lại nên chọn để trích ly cao phân đoạn. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của các cao phân đoạn thu được cho thấy F1 có hoạt tính cao nhất. Hoạt tính kháng oxy hóa của F1 qua hoạt tính khử DPPH, Cu2+ với giá trị IC50 lần lượt là: 14,52 ± 0,44; 18,78 ± 2,55 µg/mL và hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro với giá trị IC50 là: 84,98 ± 5,06 µg/mL đồng thời trong in vivo (trên dòng tế bào sắc tố B16F10) ở nồng độ 25 µg/mL đã ức chế sự sản sinh melanin 50,79%. Kết quả phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) của F1 có sự hiện diện của succinic acid, ferulic acid, p-coumaric acid, cinnamic acid, 2-ethylhexyl benzoatelà những hợp chất có khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase mạnh.

Kết quả nghiên cứu đã cho thấy vỏ quả dứa là nguồn giàu hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase. Từ khóa: Dứa, GC-MS, kháng oxy hóa, Tắc Cậu, tyrosinase Chuyên ngành Công nghệ sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ ABSTRACT Pineapple is a fruit with high nutritional value belonging to the Bromeliaceae family originating from Paraguay and cultivated grown in many different ecological regions in Vietnam. The purpose of the thesis is Investigation of antioxidant and tyrosinase inhibitory ability of extracts from parts of Pineapple tree (leaves, stems, flesh and peel) in Hon Dat and Tac Cau in Kien Giang province. The thesis uses the method of species identification by morphological characterization at the same time with re-verification by sequencing method, extraction by soaking method combined with ultrasonic wave, investigation of the in vitro antioxidant capacity of the extracts was carried out through three methods including: method to neutralize free radicals DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl); Fe3+ deionization activity method; Cu2+ deionization activity method; method to investigate the inhibition of tyrosinase enzyme activity in vitro, silica gel column chromatography method to separate high fractions of Tac Cau pineapple peel.

Next, using the cell culture method and investigating the inhibition of melanin formation on the melanoma cell line B16F10 and the GC-MS spectral analysis method of the high fraction with strong antioxidant activity and strong tyrosinase inhibitor. Research results show that, Tac Cau, Kien Giang eco-regions and methanol solvent are suitable for the research of the thesis. Based on the morphological characteristics and ITS gene proved that Pineapple is Ananas genus with the scientific name (Ananas comosus (L. The quantitative results showed that, the highest total polyphenol content in the high leaf methanol sample was also the highest total flavonoid content in the pineapple peel methanol sample.

Antioxidant results from three different antioxidant activity assays showed dissimilar results. The ability to neutralize DPPH of leaf methanol extract was strongest compared to other samples, leaf-methanol extract had IC50 value (50% inhibitory concentration) was: 31.91 µg/mL, the most powerful Fe3+ deionization activity, the strongest Cu2+ deionization activity is methanol-peel with IC50 value of 97. Investigating the inhibitory activity of tyrosinase in vitro showed that the shell-methanol extract has the strongest activity compared to the remaining crude extracts, so it is recommended to prepare the fractionation by silica gel column chromatography. Investigation of antioxidant and tyrosinase inhibitory activities of the obtained fractions showed that had the highest activity among the fractions.

Antioxidant activity of F1 through reducing activity of DPPH, Cu2+ with IC50 value is 14.55 µg / mL and in vitro tyrosinase inhibitory activity with an IC50 value of: 84.06 µg/mL simultaneously in vivo (on a B16F10 pigment cell line) at concentration 25 µg/mL inhibited melanin production by 50. Results of gas chromatographic analysis of mass spectrometry (GC-MS) of F1 in the presence of Succinic acid, Ferulic acid, p-coumaric acid, Cinnamic acid, Benzoic acid, 2-ethylhexyl are compounds with resistance oxidizes and inhibits tyrosinase strongly. The results of the study showed that peel Pineapple is a rich source of secondary compounds with antioxidant and tyrosinase inhibitory activity. Keyword: Ananas comosus, antioxidant, GC-MS, Tac Cau, tyrosinase.

Chuyên ngành Công nghệ sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ LỜI CAM ĐOAN Chuyên ngành Công nghệ sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN. iii LỜI CAM ĐOAN. iv MỤC LỤC. v DANH SÁCH BẢNG.

ix DANH SÁCH HÌNH. xi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .xii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU.2 Mục tiêu luận án .3 Nội dung nghiên cứu .4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.1 Đối tượng nghiên cứu .2 Phạm vi nghiên cứu .5 Ý nghĩa của nghiên cứu .1 Ý nghĩa khoa học .2 Ý nghĩa thực tiễn .6 Tính mới của luận án. 3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .1 Tổng quan về cây dứa (Ananas comosus) .3 Đặc điểm sinh học của cây dứa .8 Chuyên ngành Công nghệ sinh học v Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ 2.2 Các nghiên cứu trong và ngoài nước .1 Những nghiên cứu ngoài nước .2 Những nghiên cứu trong nước .3 Tổng quan về các hợp chất thứ cấp thực vật .2 Terpene và các dẫn xuất của terpene .4 Tổng quan về kháng oxy hóa, chất kháng oxy hóa và cơ chế .1 Khái quát về quá trình oxy hóa tế bào .2 Khái quát về gốc tự do .3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể.4 Chất kháng oxy hóa .5 Cơ chế hoạt động của các chất kháng oxy hóa tự nhiên.5 Tổng quan về tyrosinase, cơ chế hoạt động và chất ức chế tyrosinase .1 Tổng quan về enzyme tyrosinase.2 Cơ chế hoạt động của tyrosinase .3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của tyrosinase .4 Các chất ức chế Tyrosinase .5 Cơ chế ức chế enzyme tyrosinase .6 Tiềm năng sử dụng các chất ức chế tyrosinase .6 Tổng quan về melanocyte, cơ chế hoạt động và chất ức chế .1 Tế bào hắc tố .2 Cơ chế hoạt động của melanocyte .7 Tổng quan về các phương pháp định danh thực vật .1 Nhận diện và định danh thực vật bằng đặc điểm hình thái .