Luận án nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sinh trưởng phát triển sai khác di truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus L.) - Vũ Hoàng Hiệp

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, hình ảnh, kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào trước đây. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2014 Tác giả Vũ Hoàng Hiệp i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của nhiều tập thể và cá nhân.

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Nguyễn Thị Lý Anh đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo mọi điều kiện thuận lợi và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, các thầy giáo, cô giáo, cán bộ công nhân viên của Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã sẻ chia kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể các thầy giáo, cô giáo Bộ môn Di truyền và chọn giống cây trồng, Khoa Nông học, Ban Quản lý đào tạo, Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ về mặt học vấn cũng như tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Cao đẳng Cộng đồng Hải Phòng đã tạo điều kiện cho tôi có thể đảm bảo thời gian để học tập và thực hiện luận án. Để hoàn thành được luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, động viên chân tình của các thành viên trong gia đình, các bạn bè, đồng nghiệp,. Tôi xin được trân trọng ghi nhớ và cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó. Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2014 Tác giả Vũ Hoàng Hiệp ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt vii Danh mục các bảng viii Danh mục các hình x MỞ ĐẦU 1 1 Tính cấp thiết của đề tài 1 2 Mục tiêu nghiên cứu 2 3 Yêu cầu của đề tài 2 4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 5 Đóng góp mới của luận án 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1 Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng 5 1.1 Nguồn gốc, phân loại 5 1.2 Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng 7 1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng 7 1.4 Yêu cầu dinh dưỡng 8 1.2 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước 9 1.1 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới 9 1.2 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng tại Việt Nam 11 1.3 Ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong nhân giống cây hoa cẩm chướng 12 1.4 Đột biến tạo biến dị di truyền và ứng dụng đột biến trong chọn tạo giống cây trồng 16 1.1 Đột biến tạo biến dị di truyền 16 1.2 Các tác nhân gây đột biến 17 1.3 Vai trò của đột biến nhân tạo trong công tác chọn tao giống cây trồng 21 iii 1.5 Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng 24 1.1 Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro 24 1.2 Các phương pháp xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro 25 1.3 Nguồn vật liệu xử lý đột biến in vitro 29 1.4 Sàng lọc thể đột biến 29 1.6 Một số kết quả nghiên cứu về cây hoa cẩm chướng 30 1.1 Kết quả nghiên cứu trên thế giới 30 1.2 Kết quả nghiên cứu trong nước 35 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Vật liệu nghiên cứu 39 2.2 Nội dung nghiên cứu 41 2.1 Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa 41 2.2 Nghiên cứu các phương pháp xử lý gây tạo đột biến in vitro cho cây cẩm chướng 41 2.3 Nghiên cứu phân lập các dạng chồi in vitro biến dị sau xử lý và đánh giá sự sinh trưởng phát triển của các dạng chồi 41 2.4 Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển và phân lập các dạng biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên 42 2.5 Nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng biến dị có triển vọng đã phân lập bằng chỉ thị SSR 42 2.6 Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng đột biến được tuyển chọn 42 2.3 Phương pháp nghiên cứu 42 2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 42 2.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.3 Phương pháp gây tạo đột biến in vitro 47 2.4 Phương pháp đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đột biến bằng chỉ thị phân tử SSR 50 2.5 Phương pháp theo dõi, đánh giá 53 iv 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 55 2.5 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 54 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 56 3.1 Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa 56 3.1 Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu 55 3.2 Nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro 56 3.3 Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh 62 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm 63 3.2 Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng in vitro bằng EMS và tia gamma nguồn 60Co 65 3.1 Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy in vitro bằng EMS 65 3.2 Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy in vitro bằng tia gamma nguồn 60Co 75 3.3 Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho cây hoa cẩm chướng in vitro 80 3.3 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi in vitro 84 3.1 Nghiên cứu khả năng ra rễ của các dạng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý 85 3.2 Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện khí canh 86 3.3 Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng 88 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý gây tạo đột biến đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng 89 3.1 Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng 96 v 3.2 Ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng 96 3.3 Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng 96 3.4 Đặc điểm hình thái một số dạng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng 97 3.5 Nghiên cứu đánh giá sai khác di truyền của một số dòng cẩm chướng bằng kỹ thuật SSR 103 3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 103 3.2 Kết quả phân tích sự nhân bản DNA với các cặp mồi 104 3.3 Kết quả phân tích chỉ số PIC với các cặp mồi 115 3.4 Đánh giá độ thuần di truyền của các dòng cẩm chướng nghiên cứu 117 3.5 Hệ số đồng dạng và mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống cẩm chướng 117 3.6 Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng đột biến được tuyển chọn 121 3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu 122 3.2 Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro của các dòng cẩm chướng đột biến được tuyển chọn.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin đến khả năng tạo cây in vitro hoàn chỉnh của hai dòng cẩm chướng H6 và H7 125 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm 126 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 129 1 Kết luận 129 2 Đề nghị 130 Danh mục công trình đã công bố có liên quan đến luận án 131 Tài liệu tham khảo 132 Phụ lục 141 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ AFLP Amplicon fragment length polymorphism BA Benzyl adenin BAP 6-Benzylamino purine CT Công thức CS Cộng sự DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid DES Dimethylsulfate ĐC Đối chứng EI Ethylenimine EMS Ethylmethane sulphonate FAO Food and Agriculture Organization IAA 3-Indoleacetic acid IAEA International Atomic Energy Agency IBA α-Indol butyric acid LD50 Liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm LPB Protocorm-Like-Bodies MS Môi trường Murashige and Skoog NEU Nitrosoethylurea NMU Nitrosomethylurea NXB Nhà xuất bản PIC Polymorphic Information Content r Hệ số tương quan RAPD Random amplified polymorphic DNA RFLP Restriction fragment length polymorphisms SSR Simple sequence repeats TDZ Thidiaruzon α NAA α-Napthaleneaxetic acid vii DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Diện tích trồng và năng suất hoa cẩm chướng ở một số nước năm 2000 10 1.3 Số giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp gây tạo đột biến ở một số quốc gia tính đến năm 2007 23 2.1 Trình tự nucleotit của các primer được sử dụng trong các phản ứng SSR-PCR 39 3.1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống 55 3.2 Ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro 58 3.3 Ảnh hưởng của của tổ hợp kinetin và auxin đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro 61 3.4 Ảnh hưởng của α-NAA và than hoạt tính trong môi trường MS tới khả năng ra rễ của chồi in vitro 63 3.5 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro ngoài vườn ươm 64 3.6 Ảnh hưởng của EMS đến khả năng sống, phát sinh chồi in vitro cây cẩm chướng 66 3.7 Sự biến động tỷ lệ mẫu chết qua các tuần nuôi cấy 69 3.8 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro cây cẩm chướng với thời gian xử lý 1 giờ 72 3.9 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro cây cẩm chướng với thời gian xử lý 2 giờ 72 3.10 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro cây cẩm chướng với thời gian xử lý 3 giờ 73 3.