Luận án tiến sĩ: Phân lập, định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và sản xuất kháng thể phòng bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ PHẠM CÔNG UẨN PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VIRUS VIÊM GAN VỊT Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SỸ CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC NĂM 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ PHẠM CÔNG UẨN PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VIRUS VIÊM GAN VỊT Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SỸ CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 01 07 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.HỒ THỊ VIỆT THU NĂM 2019 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS.Hồ Thị Việt Thu đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án.Trần Nhân Dũng, PGS.Nguyễn Văn Thành, PGS.Nguyễn Minh Chơn, TS.Dương Thị Hương Giang, TS.Bùi Thị Minh Diệu đã động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được thực hiện các nội dung nghiên cứu trong phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Công nghệ Enzyme trong suốt quá trình thực hiện luận án. Các Sinh viên, Học viên Cao học chuyên ngành thú y đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện các nội dung nghiên cứu của luận án. Cán bộ phòng thí nghiệm Virus và Miễn dịch học của Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng; phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Công nghệ Enzyme của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án. Quý Thầy Cô và các anh chị em đồng nghiệp của Bộ môn Thú y, trường Đại học Cần thơ Quý Thầy Cô giảng dạy Chương trình Nghiên cứu sinh chuyên ngành Vi sinh vật học, đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập.

Xin chân thành cảm ơn tất cả người thân đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian thực hiện và hoàn thành luận án này. Tác giả Phạm Công Uẩn i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những kết quả trình bày trong luận án này là công trình nghiên cứu của NCS Phạm Công Uẩn với sự hướng dẫn của PGS.Hồ Thị Việt Thu. Tất cả các số liệu, kết quả trình bày trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố riêng lẻ trong bất kỳ công trình nào trước đây. Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án PGS.Hồ Thị Việt Thu NCS.Phạm Công Uẩn ii MỤC LỤC Trang Lời cảm tạ………………………………………………………………….i Lời cam đoan……………………………………….ii Mục lục……………………………………………………………………….iii Danh sách bảng…………………………………….ix Danh sách hình…………………………………………………………….xi Danh mục từ viết tắt……………………………………………………….xvii Chương 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài…………………………………………….3 Những đóng góp mới về khoa học…………………………………………2 Chương 2.

Lược khảo tài liệu………………………………………………. Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan vịt do virus ….2 Bệnh viêm gan vịt do virus.1 Đặc điểm tác nhân gây bệnh.2 Sự xâm nhập và đường lây lan.3 Cơ chế sinh bệnh.4 Đặc điểm dịch tễ.5 Triệu chứng và bệnh tích.6 Chẩn đoán và phòng bệnh.2 Phòng bệnh.3 Sinh học phân tử virus viêm gan vịt …………………………………….1 Hình thái và cấu tạo của virus viêm gan vịt type I ………………………9 iii 2.2 Thành phần hệ gen của virus viêm gan vịt type I ………………………10 2.3 Cấu trúc hệ gen và protein của virus viêm gan vịt type I ………………10 2.4 Đặc tính kháng nguyên và khả năng gây bệnh của virus ……………….5 Xếp loại virus viêm gan vịt …………………………………………….4 Đặc tính sinh học của virus viêm gan vịt.1 Nuôi cấy trên phôi trứng.2 Nuôi cấy trên môi trường tế bào.3 Nuôi cấy trên động vật cảm thụ.4 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt.5 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt do virus trong nước và trên thế giới trong thời gian gần đây ……………………………………….1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới …………………………………….2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam …………………………………….6 Kháng thể IgY của gà ……………………………….1 Tính chất phân tử của kháng thể IgY ……………………………….2 Đặc tính hóa lý của kháng thể IgY …………………………………….3 Sự truyền kháng thể IgY từ máu gà mẹ sang lòng đỏ trứng.7 Phương pháp sản xuất kháng thể từ lòng đỏ trứng gà ….1 Gây tối miễn dịch cho gà mái.2 Đường tiêm chủng cho gà mái.3 Tần số và khoảng cách giữa các lần tiêm chủng cho gà mái.4 Chiết xuất kháng thể IgY.5 Các phương pháp tinh sạch kháng thể IgY.1 Phương pháp kết tủa bằng muối ammonium sulphat .2 Phương pháp thẩm tích.3 Sắc ký trao đổi ion.8 Những ứng dụng kháng thể IgY trong phòng và trị bệnh trên gia cầm .9 Thành tựu phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus ở Việt Nam ……26 iv Chương 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.1 Nội dung nghiên cứu.2 Phương tiện nghiên cứu.1 Thởi gian và địa điểm.2 Vật liệu nghiên cứu.3 Hóa chất và môi trường.3 Phương pháp nghiên cứu.1 Phân lập và định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long .1 Phương pháp lấy mẫu.2 Phương pháp xử lý mẫu.3 Phương pháp phân lập virus viêm gan vịt trên môi trường phôi trứng vịt.4 Phương pháp cấy truyền virus viêm gan vịt trên môi trường tế bào xơ phôi vịt sơ cấp.5 Định danh virus viêm gan vịt bằng sinh học phân tử.2 Nghiên cứu di truyền virus viêm gan vịt type I genotype 3.1 Giải trình tự nucleotide sản phẩm RT-PCR.2 Nghiên cứu di truyền của các chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 phân lập được….3 Khảo sát độc lực của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên phôi vịt và trên vịt con….1 Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào xơ phôi vịt của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 …………………………………34 3.2 Xác định liều gây chết 50% phôi vịt và khảo sát bệnh tích biểu hiện trên phôi của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 ……….3 Xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm và khảo sát đặc điểm bệnh lý của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 ….4 Khảo sát bệnh tích vi thể từ mẫu bệnh phẩm của vịt khảo sát LD50 .4 Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà mái và ứng dụng trong phòng, trị bệnh.1 Tạo miễn dịch cho gà mái …………….2 Tách chiết kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà.3 Kiểm tra hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái và lòng đỏ trứng gà.4 Xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà đối với tế bào xơ phôi vịt.5 Khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ trước khi gây nhiễm……………………………………………………43 3.6 Khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ sau khi gây nhiễm…………………………………………………….7 Xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt 12 ngày tuổi của kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà bằng phản ứng trung hòa virus.8 Thử nghiệm hiệu quả phòng bệnh do virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên vịt con…….9 Thử nghiệm hiệu quả trị bệnh do virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên vịt con…….5 Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả và thảo luận.1 Kết quả phân lập và định danh virus gây bệnh viêm gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long.1 Kết quả phân lập virus viêm gan vịt trên môi trường phôi vịt.2 Kết quả cấy truyền virus viêm gan vịt trên môi trường tế bào xơ phôi vịt sơ cấp.3 Kết quả định danh virus viêm gan vịt bằng kỹ thuật sinh học phân tử.2 Kết quả khảo sát đặc điểm di truyền phân tử của các chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 đã phân lập.1 Kết quả giải trình tự nucleotide sản phẩm RT-PCR.2 Tìm kiếm sự tương đồng với virus viêm gan vịt type I genotype 3 khác đã đăng ký trong Ngân hàng gen Thế giới.3 So sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide và axít amin giữa các chủng phân lập với các chủng khác trong Ngân hàng gen Thế giới.3 Kết quả khảo sát độc lực của virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên phôi vịt và trên vịt con…………………………………………….1 Kết quả khảo sát độc lực và tính gây bệnh của virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên phôi vịt…………………………………………65 4.1 Kết quả xác định liều gây chết 50% phôi vịt thí nghiệm…………….2 Kết quả khảo sát thời gian chết phôi trung bình theo nồng độ……….3 Biểu hiện bệnh tích trên phôi vịt thí nghiệm………………………….2 Kết quả khảo sát độc lực và tính gây bệnh của virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên vịt con………………………………………….1 Kết quả xác định liều gây chết 50% trên vịt con…………………….2 Khảo sát thời gian vịt chết trung bình theo nồng độ virus khác nhau………………………………………………………………….3 Khảo sát triệu chứng lâm sang ở vịt thí nghiệm …………………….4 Khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thí nghiệm qua mổ khám ……….5 Khảo sát bệnh tích vi thể trên vịt thí nghiệm …………………………79 4.4 Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà mái………………………….1 Kết quả phân tích hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái……….2 Mối tương quan giữa hàm lượng kháng thể IgY trong máu gà và trong trứng gà sau khi gây miễn dịch…………………………………………90 4.3 Trích ly kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà bằng phương pháp tủa phân đoạn muối Amonium sulphat 40%.4 Khảo sát độc tính của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà đối với tế bào xơ phôi vịt và tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên tế bào xơ phôi vịt………………………………………93 4.1 Kết quả xác định liều gây nhiễm 50% tế bào xơ phôi vịt của virus viêm gan vịt type I genotype 3……………………………….2 Kết quả xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY lòng đỏ đối với tế bào xơ phôi vịt……………………………………………………94 4.3 Hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ trước khi gây nhiễm……….4 Hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trên tế bào xơ phôi vịt ờ 24 giờ sau khi gây nhiễm…………………………………………………………….5 Ứng dụng dịch kháng thể IgY lòng đỏ trong phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus type I genotype 3……………………………….1 Kết quả xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt 12 ngày tuổi của dịch kháng thể IgY lòng đỏ………………………………………………99 4.2 Kết quả phòng bệnh viêm gan vịt do virus viêm gan vịt type I genotype 3 bằng dịch kháng thể IgY lòng đỏ trên vịt con 3 ngày tuổi………………………………………………………………….