Luận án nghiên cứu đặc tính vi khuẩn Escherichia coli nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn tại các điểm giết mổ Hà Nội

1 MỞ ẦU 1 Tính cấp thiết củ đề tài Trên phạm vi thế giới, ước tính hàng năm có khoảng 2 tỷ người bị ngộ độc thực phẩm (Đậu Ngọc Hào, 2011) [2]. Ở Việt Nam, theo ước tính và thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO) có khoảng 8 triệu người bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm, trong đó phần lớn xảy ra tại các bếp ăn tập thể, khu công nghiệp, bếp ăn của học sinh. Năm 2010, cả nước xảy ra 175 vụ ngộ độc thực phẩm, làm hơn 5.000 người mắc và 42 trường hợp tử vong. Thiệt hại kinh tế cho chi phí điều trị bệnh và nghỉ làm việc khoảng 8 triệu USD/năm (Phương Thuận, 2011) [101].

Các con số trên đây cho thấy một thực trạng đáng lo ngại về vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP). VSATTP có vai trò rất quan trọng đối với cuộc sống con người, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe, tuổi thọ, chất lượng môi trường, chất lượng cuộc sống, phát triển kinh tế và uy tín thương hiệu sản phẩm, uy tín quốc gia. Trong số rất nhiều nguyên nhân vi sinh vật gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm ở người (Salmonella, E. coli, Vibrio cholera, Listeria, Clostridium botulinum .), những năm gần đây, các vi khuẩn E.

coli thuộc nhóm Verotoxigenic (VTEC) ngày càng được biết đến như là một trong những tác nhân quan trọng. coli là khái niệm dùng để chỉ nhóm các vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra độc tố Verotoxin hoặc Shiga-like toxin. Các chủng VTEC là nguyên nhân gây ra các ca bệnh lẻ tẻ hoặc các ổ dịch lớn bệnh viêm ruột xuất huyết (HC) và hội chứng urê huyết (HUS), ban xuất huyết giảm tiểu cầu (TTP), viêm đường niệu (Urinary tract infections), viêm màng não (meningitis) (XU và cs.

coli O157: H7 vẫn được biết đến như là một serotyp chính 2 phân lập được từ các vụ dịch ở hầu hết các quốc gia, các chủng VTEC thuộc các serotyp khác cũng đã được chứng minh là có mối liên quan chặt chẽ với các vụ dịch tương tự như serotyp O111 ở Canada, Italia, Đức và Australia, O103 ở Pháp, Italia và O104 ở Mỹ. Ở rất nhiều quốc gia, VTEC là tác nhân gây bệnh tiêu chảy rất hay gặp (Wachsmuth, 1994) [95]. Ví dụ, ở Đức, VTEC được phân lập từ trẻ em bị tiêu chảy là nguyên nhân vi khuẩn thường gặp đứng thứ 2, sau Salmonella và ở Áo, VTEC là nguyên nhân thường gặp thứ 3, sau Salmonella và Campylobacter (Allerberger và cs. Gần đây nhất, tháng 6 năm 2011, một đợt dịch do E.

coli đã bùng phát tại Đức và nhanh chóng lan ra các quốc gia châu Âu khác. WHO cho biết, trên phạm vi toàn thế giới có hơn 1.270 ca nhiễm và 552 ca tiến triển thành HUS; con số tử vong lên tới 18 người bao gồm 17 trường hợp ở Đức và 1 trường hợp ở Thụy Điển. Nguyên nhân của đợt dịch được xác định là do rau quả bị nhiễm E. Vụ dịch này gây tổn thất nặng nề tới nền kinh tế thuộc liên minh châu Âu (EU), ước tính mỗi tuần người nông dân tại đây thất thu 200 triệu euro (tương đương 290 triệu USD).

Ở động vật, VTEC là nguyên nhân gây ra chứng viêm ruột xuất huyết và tiêu chảy ở bò, gây phù đầu ở lợn. Động vật nhai lại, đặc biệt bê và bò là nguồn tàng trữ mầm bệnh tiềm tàng và việc tiêu thụ các loại thực phẩm (thịt bê, bò, các sản phẩm sữa) chưa qua xử lý kỹ là nguyên nhân chính gây ra các trường hợp bị bệnh ở người do VTEC. Các nghiên cứu tại một số quốc gia về sự tạp nhiễm phân ở các trang trại chăn nuôi bò sữa, đã chỉ ra sự dao động rất lớn về tỷ lệ nhiễm của các chủng VTEC thuộc nhóm O157 (từ 0,2 đến 48,8%) và không thuộc nhóm O157 (từ 0,4 đến 74,0%). Trong những thập kỷ gần đây, ô nhiễm vi khuẩn E.

coli thuộc nhóm VTEC sản sinh độc tố Verotoxin (VT) trong thực phẩm đã trở thành đề tài nghiên cứu của nhiều tác giả vì tính nghiêm trọng của các bệnh do vi khuẩn 3 này gây ra ở người (Bergamini, 2007) [16]. Việc xác định chính xác loại vi khuẩn thuộc nhóm này là rất cần thiết, do mối nguy hại của vi khuẩn này liên quan đến các nạn dịch tiêu chảy trầm trọng ở người và khả năng truyền lây bệnh của chúng thông qua thức ăn có nguồn gốc động vật. Hiểu biết về các đặc tính của vi khuẩn VTEC ở thịt các loài động vật nuôi (bò, lợn…) làm thực phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống cảnh báo sớm và tiến hành các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp. Nhiều công trình nghiên cứu đã được thực hiện và công bố ở hầu khắp các quốc gia trên thế giới.

Tuy nhiên, ở Việt Nam vấn đề này vẫn chưa được chú ý. Để có được những hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC trong thực trạng giết mổ và chế biến thực phẩm tại Việt Nam, chúng tôi đặt vấn đề thực hiện đề tài: "Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội ” 2 Mục tiêu củ đề tài - Xác định đặc tính của vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn tại điểm giết mổ. - Xây dựng được quy trình chẩn đoán, xác định vi khuẩn VTEC trong sản phẩm thịt tươi.

3 Ý n hĩ h học và thực tiễn củ đề tài - Đề tài luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống về vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội. - Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp chúng ta xác định và hiểu được một số đặc tính cơ bản của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn. - Một số kỹ thuật mới và phương pháp phân tích kết quả có hệ thống của đề tài luận án có thể ứng dụng trong nghiên cứu một số vi khuẩn khác ở mức độ phân tử cũng như tài liệu giảng dạy về vi khuẩn nhóm VTEC.

- Hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC ở các loài động vật nuôi làm thực 4 phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống cảnh báo sớm và tiến hành các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp. 4 hữn đón óp m i củ luận án - Đề tài luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu đặc tính của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn tại cơ sở giết mổ và một số sản phẩm thịt bò, lợn bày bán trên một số chợ tại địa bàn Hà Nội. - Thiết lập thành công phương pháp Multiplex PCR để xác định vi khuẩn nhóm VTEC trên thịt trong điều kiện Việt Nam. - Sử dụng phương pháp PCR, PFGE để xác định các yếu tố độc lực của vi khuẩn E.

coli và xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có nguồn gốc khác nhau. coli Hơn 100 năm trước, năm 1885, bác sỹ nhi khoa người Đức Theodore Escherich đã lần đầu tiên mô tả một loài vi khuẩn phân lập được từ phân của một bệnh nhân nhi. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacterium coli commune, và sau nhiều lần đổi tên, vào năm 1919, vi khuẩn này được gọi với một tên thống nhất là Escherichia coli, viết tắt là E. Từ đó đến nay, E.

coli được xác định là loài vi khuẩn thường gặp nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật (Vu Khac Hung, 2004) [91]. coli là loài chủ yếu của giống Escherichia, họ Enterobacteriaceae. Chúng là những vi khuẩn bắt màu Gram âm, hình gậy ngắn. Quan sát dưới kính hiển vi thường thấy vi khuẩn đứng riêng hoặc thành đôi.

Phản ứng Catalase dương tính, Oxidase âm tính, hiếu khí tùy tiện, có thể di động nhờ lông (flagella) hoặc không di động. Hầu hết các chủng vi khuẩn đều lên men đường Lactose, một số lên men chậm và một số không sinh hơi. Thông thường, E. coli có phản ứng Citrate âm tính, Methyl Red (MR) dương tính, Voges - Proskauer (VP) âm tính và Indol dương tính.

coli là vi khuẩn thường thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật; từ đó E. coli được thải vào nước, đất và đồng cỏ, không chỉ nhiễm lan trong đàn mà có thể nhiễm vào một số sản phẩm nông nghiệp như rau, củ,. Từ đầu những năm 1940, một số ý kiến cho rằng vi khuẩn E. coli là tác nhân gây một số bệnh ở trẻ em.

Doyle và Padhye (trích dẫn từ Bray và Beavan, 1989) [28] gọi vi khuẩn này là Bacillus coli typ neopolitanum, mà sau này được gọi là nhóm O111, và thuộc lớp EPEC. Từ đó, những nhóm E. coli khác được thừa nhận là nguyên nhân gây tiêu chảy. coli gây bệnh có độc lực rất khác nhau và có khả năng gây ra một số bệnh nghiêm trọng.

Một số chủng sản sinh độc tố gây phá hủy tế bào Vero và Hela, tương tự như độc tố do Shigella dysenteriae typ 1 sản sinh ra. Những độc tố này được gọi với những tên khác nhau như Verotoxin, Verocytotoxin hoặc Shiga-like toxin. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tên gọi thống nhất là Verotoxin (VT) và các vi khuẩn có khả năng sản sinh độc tố này được gọi là Verotoxigenic Escherichia coli, viết tắt là VTEC. Trong những năm gần đây, các chủng E.

coli gây tiêu chảy được chia thành ít nhất 5 nhóm. coli gây độc ruột (ETEC - Enterotoxigenic E. coli) - sản sinh độc tố ruột nhưng không xâm nhập, E. coli xâm nhập ruột (EIEC - Entero invasive E.

coli) có khả năng xâm nhập tế bào biểu mô ruột, E. coli gây bệnh tích ruột (EPEC - Enteropathogenic E. coli) có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô và gây bệnh tích bám dính và xâm nhập (Attaching and Effacing - A/E), E. coli gây ngưng kết (EaggEC - Enteroaggregative E.

coli) có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô nhờ một cơ quan giống lông nhung và khuếch tán vào trong biểu mô ruột. Nhóm cuối cùng là VTEC gây bệnh viêm ruột xuất huyết, huyết niệu và ban xuất huyết giảm tiểu cầu ở người. Trước đây, VTEC là một phân nhóm của EPEC vì chúng cũng có khả năng gây bệnh tích A/E ở biểu mô ruột của động vật cảm thụ. Nhưng khi phát hiện một số chủng của VTEC có khả năng sản sinh độc tố VT để trợ giúp cho yếu tố bám dính này, chúng đã được tách ra thành một nhóm riêng là VTEC.

coli O157: H7 hiện nay là chủng VTEC được báo cáo nhiều nhất gây ra các vụ dịch lớn ở nhiều nước gồm cả Mỹ (MacDonald và Osterholm, 1993) [55], Canada (Waters và cs. 1994) [96], Anh (Thomas và cs.