Đột biến EGFR và methyl hóa gen trong ung thư biểu mô tuyến phổi - Luận án TS Nguyễn Ngọc Quang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN NGỌC QUANG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN NGỌC QUANG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 942 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Chu Hoàng Hà 2. Nguyễn Phi Hùng Hà Nội – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng nghiên cứu, cộng tác với các nhà khoa học khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành cũng như các hội nghị trong nước và quốc tế với sự đồng ý và cho phép của đồng tác giả; những kết quả còn lại trong luận án chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Quang Nguyễn Ngọc Quang LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.

Chu Hoàng Hà, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án. Thầy không chỉ truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực hiện luận án là hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này. Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi xin trân trọng cảm ơn TS.

Nguyễn Phi Hùng, Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K. Thầy đã luôn hướng dẫn, động viên, dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong những lúc tôi gặp khó khăn. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. Tạ Văn Tờ, TS.

Vương Diệu Linh và các đồng nghiệp thuộc Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công Nghệ Sinh học đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua. Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho bố mẹ, bạn bè đã luôn tin tưởng, thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn trong thời gian qua, giúp tôi hoàn thành tốt luận án này. Nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Quang MỤC LỤC MỞ ĐẦU.

Ung thư phổi. Thực trạng ung thư phổi. Phân loại ung thư phổi. Các giai đoạn ung thư phổi.

Ung thư biểu mô tuyến của phổi .1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến. Các phân típ mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến. Biến đổi gen EGFR trong ung thư phổi. Cấu trúc và chức năng gen EGFR.

Đột biến gen EGFR trong ung thư phổi. Biểu hiện protein EGFR trong ung thư phổi. Methyl hóa DNA trong ung thư phổi. Methyl hóa các gen EGFR, BRCA1, MLH1, MGMT và RASSF1A trong ung thư phổi.

Điều trị đích trong ung thư và ung thư phổi. Điều trị đích trong ung thư. Điều trị đích trong ung thư phổi. Phương pháp phân tích biến đổi phân tử trong ung thư phổi.

Phương pháp phân tích đột biến gen trong ung thư phổi. Phương pháp phân tích methyl hóa DNA trong ung thư phổi. Nghiên cứu các dấu ấn phân tử trong ung thư phổi ở Việt Nam. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.

Mẫu nghiên cứu. Thiết bị chính. Phương pháp nghiên cứu. Tách chiết DNA tổng số và xác định nồng độ DNA.

Xử lý bisulfite với DNA tổng số. Phương pháp PCR. Phương pháp điện di. Phương pháp xác đinh đột biến gen EGFR.

Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch. Phương pháp tạo trình tự DNA methyl bằng enzyme M. Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học. 50 CHƢƠNG III.

Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu. Đột biến và biểu hiện gen EGFR .1 Đột biến gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân. Biểu hiện protein EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân. Tình trạng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của phổi.

Methyl hóa gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân. Methyl hóa gen BRCA1 và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân. Methyl hóa gen MGMT và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân. Methyl hóa gen MLH1 và sự tương quan đặc điểm bệnh nhân.

Methyl hóa gen RASSF1A và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư tuyến của phổi. Tương quan giữa đột biến, biểu hiện và methyl hóa gen EGFR. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa các gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A.

Tương quan về tình trạng methyl giữa các gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của phổi. 74 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN. Đặc điểm phân tử gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi. Đột biến vùng hoạt hóa Tyrosine Kinase gen EGFR.

Biểu hiện quá mức của protein EGFR. Methyl hóa vùng promoter EGFR. Tương quan giữa các đặc điểm phân tử gen EGFR. Methyl hóa gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi.

Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1. Methyl hóa vùng promoter gen MGMT. Methyl hóa vùng promoter gen MLH1. Methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A.

Tương quan giữa những đặc điểm phân tử gen EGFR với sự methyl hóa BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A trong ung thư biểu mô tuyến của phổi. Đột biến EGFR với sự methyl hóa quá mức các gen ức chế khối u. Biểu hiện EGFR với sự methyl hóa các gen ức chế khối u. Sự methyl hóa đồng thời của một số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của phổi.

95 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ. 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 97 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ A260 Độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm Atipical Adenomatous Hyperplasias (Tế bào phân chia quá mức AAH không điển hình) ABL Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 gene ACS American Cancer Society (Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ) AIS Adenocarcinoma in situ (Ung thư tại chỗ) ALK Anaplastic Lymphoma Kinase gene ALK-EML4, Chuyển đoạn ALK-EML4, BCR-ABL BCR-ABL APC Adenomatous polyposis of the colon gene BAC Bronchioloalveolar Carcinoma (Ung thư biểu mô tiểu phế nang) BCR Breakpoint Cluster Region gene BRCA1 Breast cancer susceptibility gene (Gen nhạy cảm với ung thư vú) BRAF v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B CD74 Cluster of Differentiation 74 gene CHFR Checkpoint With Forkhead And Ring Finger Domains CK5/6 Cytokeratin 5/6 protein CK7 Cytokeratin 7 protein Combined Bisulfite Restriction Analysis (Phân tích kết hợp COBRA Bisulfite và cắt giới hạn) cs. Cộng sự DAB 3, 3 –diaminobenzidine DAPK Death‐associated protein kinase DNA Acid deoxyribonucleic DNMTs DNA methyltransferase (Enzyme methyl hóa DNA) dNTP Deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EGFR Epidermal growth factor receptor (Yếu tố phát triển biểu mô) ER Estrogen receptor (thụ thể estrogen) Food and Drug Administration (Hiệp hội thực phẩm và thuốc FDA Hoa Kỳ) FFPE Formalin fixed paraffin embedded FISH Fluorescence In Situ Hybridization (Lai tại chỗ huỳnh quang) GTP Guanosine triphosphate GDP Guanosine diphosphate GSTP1 Glutathione S-transferase Pi 1 gene H&E Hematoxylin & Eosin HDACs Histone deacetylase HRM High Resolution Melting (Độ phân giải cao nhiệt độ nóng chảy) HPR Horseradish Peroxidase International Agency for Research on cancer (Tổ chức nghiên IARC cứu ung thư thế giới) IHC Immunohistochemistry (Hóa mô miễn dịch) MAPK Mitogen-activated protein kinase MDR Multidrug resistance gene MEK Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 1 (MAP2K1) MET Mesenchymal-epithelial transition factor MIA Minimally Invasive Adenocarcinoma MGMT O-6-methylguanine-DNA methyltransferase gene MLH1 MutL homolog 1 gene MsssI CpG methyltransferase MS-PCR Methylation Specific PCR (PCR đặc hiệu methyl) MYC Myelocytomatosis genes NGS Next Generation Sequencing (Giải trình tự thế hệ mới) NSCLC Non-small cell lung cancer (Ung thư phổi không tế bào nhỏ) PI3K Phosphoinositide 3-kinases PTEN Phosphatase and tensin homologue PR Progesterone Receptor (Thụ thể progesterone) RASSF1A Ras association domain family 1A gene RARP2 The retinoic acid receptor P gene Ras Rat sarcoma RB2 Retinoblastoma-like protein 2 RET Rearranged during transfection ROS1 c-ros oncogene 1gene SAM S-adenosylmethionine SCLC Small cell lung cancer (Ung thư phổi tế bào nhỏ) SDC4 Syndecan 4 gene SLC34A2 Solute Carrier Family 34 Member 2 gene SNP Single Nucleotide Polymorphism (Sự đa hình nucleotide) Single-strand conformation polymorphism (đa hình cấu trúc sợi SSCP đơn) TAE Tris-acetate-EDTA TBE Tris-borate-EDTA TEMED N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine TKIs Tyrosine Kinase Inhibitors (Các chất ức chế Tyrosine Kinase) TIMP3 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 3 gene TTF-1 Transcription Termination Factor 1 (Yếu tố kết thúc phiên mã 1) WHO World Heath Organization (Tổ chức Y tế thế giới) WNT Wingless genes YAP Yes-associated protein DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên thế giới 5 Hình 1.2 Số ca mắc ung thư mới tại Việt Nam năm 2018 5 Hình 1.3 Phân loại mô bệnh học trong ung thư phổi 7 Hình 1.4 Quá trình hình thành ung thư biểu mô tuyến 11 Hình 1.5 Một số phân típ phổ biến trong ung thư biểu mô tuyến của phổi 12 Hình 1.6 Đường truyền tín hiệu thông qua phân tử EGFR 14 Hình 1.7 Tần suất các dạng đột biến gen EGFR 15 Hình 1.8 Methyl hóa DNA ở tế bào bình thường và tế bào ung thư 19 Hình 1.9 Các vị trí methyl hóa trên gen EGFR 22 Hình 1.10 Cấu trúc gen BRCA1ở người 22 Hình 1.11 Chức năng ức chế khối u của BRCA1 23 Hình 1.12 Cấu trúc gen MLH1 24 Hình 1.13 Các phức hợp sửa chữa DNA của MLH1 24 Hình 1.14 Cấu trúc gen MGMT 26 Hình 1.15 Cơ chế sửa chữa DNA của MGMT 26 Hình 1.16 Cấu trúc của gen RASSF1A và các đồng phân 27 Hình 1.17 Chức năng ức chế khối u của RASSF1A 28 Hình 1.18 Điều trị đích trong ung thư phổi 32 Hình 1.19 Một số kỹ thuật phát hiện đột biến gen 35 Hình 1.