Luận án Tiến sĩ: Tách chiết enzyme protease tôm sú ứng dụng chế biến thủy sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG -------- Nguyễn Lệ Hà NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE TỪ TÔM SÚ PENAEUS MONODON VÀO CHẾ BIẾN THỦY SẢN LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Nha Trang 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG -------- Nguyễn Lệ Hà NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE TỪ TÔM SÚ PENAEUS MONODON VÀO CHẾ BIẾN THỦY SẢN Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 62 54 10 05 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TRẦN THỊ LUYẾN 2. TS ĐỒNG THỊ THANH THU Nha Trang 2011 LỜI CÁM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và thực hiện luận án, tôi đã nhận được sự quan tâm tận tình của quý thầy cô hướng dẫn khoa học, các tập thể, các cá nhân trong và ngoài trường, đã góp phần vào sự hòan thành luận án này. Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc tới các cô giáo hướng dẫn: GS.

Trần Thị Luyến, Nguyên Hiệu phó trường Đại học Nha Trang, PGS. Đồng Thị Thanh Thu, Nguyên Trưởng bộ môn Hóa sinh trường Đại học tổng hợp TPHCM, những người đã hết lòng chỉ bảo tận tình, thường xuyên theo dõi quá trình thực hiện luận án, góp phần làm nên kết quả của luận án này. Xin chân thành cảm ơn PGS. TS Nguyễn Tiến Thắng, CN Đỗ Thị Tuyến, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh, Th.S Nguyễn Thị Nguyệt Thu, Trưởng phòng Miễn dịch Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh, PGS.

TS Ngô Đăng Nghĩa vì những ý kiến đóng góp và sự giúp đỡ trong quá trình thực nghiệm. Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học Trường Đại học Nha Trang, Ban giám hiệu và Viện Công nghệ Sinh học & Thực phẩm Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều tiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và bảo vệ luận án. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè đã quan tâm, chia sẻ khó khăn và động viên để tôi hoàn thành công việc. Nguyễn Lệ Hà LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tác giả luận án MỤC LỤC TRANG DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT. i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU. i DANH SÁCH HÌNH.

ii DANH SÁCH BẢNG. vii DANH SÁCH SƠ ĐỒ. viii MỞ ĐẦU. 1 Chương 1- TỔNG QUAN.1 GIỚI THIỆU VỀ TÔM SÚ Penaeus monodon.1 Cấu tạo và đặc điểm sinh học của tôm sú.2 Tập tính ăn của tôm sú.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME VÀ PROTEASE TRONG THỦY SẢN.1 Giới thiệu chung về enzyme .2 Phương pháp tách và làm sạch enzyme .3 Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel.4 Protease của động vật thủy sản.

NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TỪ CÁ VÀ THỦY SẢN VÀO MỤC ĐÍCH THỰC PHẨM. Sự phân giải có chọn lọc mô thịt cá và thủy sản. Sử dụng enzyme protease trong chiết rút carotenoprotein từ phế liệu của quá trình chế biến các loài giáp xác. Sử dụng protease vào thu nhận chitin và protein từ phế thải chế biến tôm.

Ứng dụng protease chiết rút từ cá và thủy sản thay thế rennet trong sản xuất phomai. Sử dụng enzyme protease trong sản xuất dịch cá (nước mắm). Sử dụng protease trong sản xuất bột đạm cá thủy phân .4 CAROTENOPROTEIN TRONG ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT RÚT.4 Một số phương pháp chiết rút carotenoprotein từ phế liệu chế biến động vật giáp xác. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VỀ ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE TỪ ĐỘNG VẬT THỦY SẢN.

37 Chương 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU .1 Nguyên liệu để tách chiết và tinh sạch enzyme .2 Nguyên liệu dùng trong quá trình ứng dụng enzyme protease vào thủy 41 phân.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.1 Thu nhận protease tinh sạch .2 Khảo sát các tính chất của protease sau tinh sạch .3 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme CPE thu nhận từ đầu tôm sú vào thủy phân protein từ hỗn hợp máu và gan cá basa .4 Tối ưu hóa quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan cá basa .5 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme thu nhận từ đầu tôm sú vào thủy phân phế liệu đầu và vỏ tôm thu nhận carotenoprotein .6 Tối ưu hóa quá trình thủy phân thu nhận carotenoprotein .3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU. 62 Chương 3- KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN.1 NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TINH SẠCH PROTEASE TỪ GAN TỤY VÀ ĐẦU TÔM SÚ. Các thông số cho quá trình thu nhận chế phẩm protease từ gan tụy và đầu tôm sú. Thu nhận protease tinh sạch từ chế phẩm enzyme gan tụy và đầu tôm sú Penaeus monodon bằng sắc ký lọc gel.

MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE SAU TINH SẠCH TỪ GAN TỤY VÀ ĐẦU TÔM SÚ. Trọng lượng phân tử của protease gan tụy và đầu tôm. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease sau tinh sạch. Độ bền nhiệt của protease sau tinh sạch.

Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease gan tụy và đầu tôm. Ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt độ protease sau tinh sạch 90 3.6 Ảnh hưởng của một số kim loại và chất ức chế đến hoạt độ protease tôm sú sau tinh sạch. Động học của protease gan tụy tôm sau tinh sạch .3 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN HỖN HỢP MÁU VÀ GAN CÁ BA SA BẰNG CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TÁCH CHIẾT TỪ ĐẦU TÔM SÚ.1 So sánh quá trình thủy phân bằng chế phẩm enzyme protease đầu tôm trên hỗn hợp máu và gan cá basa tươi và đã gia nhiệt .2 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme protease đến quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan cá basa gia nhiệt .3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan cá gia nhiệt.4 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân hỗn hợp máu và gan cá gia nhiệt.4 TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN HỖN HỢP MÁU VÀ GAN CÁ BASA BẰNG CHẾ PHẨM ENZYME TỪ ĐẦU TÔM SÚ .1 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân .2 Xác định chỉ tiêu tối ưu.3 Thiết lập phương trình hồi qui của quá trình thủy phân .4 Phân tích các yếu tố ảnh hưởng, tìm thông số tối ưu của quá trình thủy phân.5 Sơ bộ đánh giá chất lượng dịch thủy phân thu được.5 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN THU NHẬN BỘT CAROTENOPROTEIN TỪ ĐẦU VÀ VỎ TÔM BẰNG CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TÁCH CHIẾT TỪ ĐẦU TÔM SÚ .1 Thành phần phế liệu đầu và vỏ tôm sú.2 Xác định điểm đẳng điện của dịch thủy phân phế liệu đầu vỏ tôm .3 Nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu đầu, vỏ tôm thu nhận bột carotenoprotein.6 TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PHẾ LIỆU ĐẦU, VỎ TÔM THU SẢN PHẨM BỘT CAROTENOPROTEIN .1 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân .2 Xác định chỉ tiêu tối ưu của quá trình thủy phân.3 Thiết lập phương trình hồi qui của hàm lượng carotenoid CP và xác định thông số tối ưu của quá trình thủy phân thu nhận carotenoprotein giàu carotenoid.4 Thiết lập phương trình hồi qui của hàm lượng protein AP và xác định thông số tối ưu của quá trình thủy phân thu nhận carotenoprotein giàu protein.5 Kiểm tra tính tương thích của các chỉ tiêu tối ưu vào thực nghiệm .6 Sơ bộ đánh giá về chất lượng của bột carotenoprotein thu nhận từ phế liệu tôm theo thông số tối ưu hóa. 158 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN.

161 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ. 164 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 165 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DC Dịch chiết CPE Chế phẩm enzyme ĐC Đối chứng PI Điểm đẳng điện S Nồng độ cơ chất V Vận tốc phản ứng thủy phân PMSF Phenylmethyl sulphonyl fluoride SBTI Soybean trypsin inhibitor TLCK Tosyl-lysine chloromethyl ketone TPCK Tosil-phenyl chloromethyl ketone EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU HL Hàm lượng peptid và acid amin mạch ngắn CP Hàm lượng carotenoid AP Hàm lượng protein hòa tan T Nhiệt độ thủy phân C Nồng độ chế phẩm enzyme tg Thời gian thủy phân DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cấu tạo ngoài và trong của tôm sú 5 1.2 Nguyên tắc hoạt động của một số loại sắc ký 10 1.3 Tách các phân tử bằng lọc gel 11 1.4 Cấu trúc hóa học của một số carotenoid 25 1.1 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-Rad 46 2.2 Thiết bị điện di 48 3.1 Ảnh hưởng của dung môi và tỉ lệ gan tụy:dung môi (w/v) đến hiệu suất thu nhận protease của dịch chiết từ gan tụy tôm sú 64 3.2 Ảnh hưởng của dung môi và tỉ lệ đầu tôm:dung môi (w/v) đến hiệu suất thu nhận protease của dịch chiết từ đầu tôm sú 64 3.3 Ảnh hưởng của dung môi và tỉ lệ nội tạng:dung môi (w/v) đến hoạt độ riêng của dịch chiết từ gan tụy tôm sú 66 3.4 Ảnh hưởng của dung môi và tỉ lệ đầu tôm:dung môi (w/v) đến hoạt độ riêng của dịch chiết từ đầu tôm sú 66 3.5 Ảnh hưởng của thời gian chiết rút đến hoạt độ protease dịch chiết từ gan tụy và đầu tôm sú 67 3.6 Ảnh hưởng của tác nhân và nồng độ chất kết tủa đến hoạt độ riêng protease của chế phẩm enzyme từ gan tụy tôm sú 69 3.7 Ảnh hưởng của tác nhân và nồng độ kết tủa đến hoạt độ riêng protease của chế phẩm enzyme từ đầu tôm sú 69 3.8 Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ riêng protease chế phẩm enzyme từ gan tụy và đầu tôm sú 70 3.9 Sắc ký đồ lọc gel chế phẩm protease tủa bằng (NH 4)2SO4 từ đầu tôm 73 3.10 Sắc ký đồ lọc gel chế phẩm protease tủa bằng ethanol từ đầu tôm sú 73 Hình Tên hình Trang 3.11 Sắc ký đồ lọc gel chế phẩm protease tủa bằng (NH 4)2SO4 từ gan tụy tôm 74 3.12 Sắc ký đồ lọc gel chế phẩm protease tủa bằng ethanol từ gan tụy tôm 74 3.13 Điện di đồ Zymogram của protease gan tụy tôm sú 76 3.14 Điện di đồ Zymogram của protease đầu tôm sú 77 3.15 Đồ thị tương quan giữa phân tử lượng protein chuẩn và khoảng cách di chuyển của chúng khi điện di trên gel polyacrylamide 12% 78 3.16 Điện di đồ Zymogram so sánh hệ protease gan tụy (a) và đầu tôm sú (b) 79 3.17 Điện di đồ Substrate-Gel so sánh hệ protease gan tụy (a) và đầu tôm sú (b) 80 3.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ tương đối của protease gan tụy và đầu tôm 84 3.