Nghiên cứu bệnh học và cơ chế đa kháng thuốc Edwardsiella ictaluri & Aeromonas hydrophila trên cá tra - Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Cần Thơ 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ QUÁCH VĂN CAO THI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC VÀ CƠ CHẾ ĐA KHÁNG THUỐC CỦA HAI LOÀI VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI THÂM CANH Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 01 07 CẦN THƠ, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ QUÁCH VĂN CAO THI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC VÀ CƠ CHẾ ĐA KHÁNG THUỐC CỦA HAI LOÀI VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI THÂM CANH Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 01 07 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TỪ THANH DUNG CẦN THƠ, 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án “Nghiên cứu đặc điểm bệnh học và cơ chế đa kháng thuốc của hai loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở Đồng bằng sông Cửu Long” là công trình nghiên cứu của tôi với sự hướng dẫn của PGS. Từ Thanh Dung. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được người khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

TÁC GIẢ LUẬN ÁN NCS. QUÁCH VĂN CAO THI i LỜI CÁM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Cô PGS. Từ Thanh Dung đã dành nhiều thời gian, công sức và tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện luận án và theo học tại trường. Trần Nhân Dũng đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho việc nghiên cứu và học tập tại Viện.

Trần Thị Tuyết Hoa, Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình hướng dẫn chuyên đề nghiên cứu sinh. Xin được gửi lời biết ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu trường Cao đẳng Cộng đồng Vĩnh Long; Ban lãnh đạo Viện NC&PT Công nghệ Sinh học và Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ; quý Thầy/Cô và các Anh/Chị phòng Thanh tra và Pháp chế đã sắp xếp công việc cũng như tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập đúng tiến độ. Cảm ơn các hộ nuôi cá tra ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long đã cung cấp mẫu cá bệnh để phân lập vi khuẩn. Chân thành biết ơn anh Trần Văn Bé Năm (phòng Sinh học phân tử, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học); em Nguyễn Bảo Trung và quý Thầy/Cô quản lý các phòng Thí nghiệm của Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản đã hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận án.

Vô cùng biết ơn anh Trần Duy Phương (Công ty Pharmaq Việt Nam, chi nhánh Đồng Tháp) đã cung cấp cá tra giống sạch bệnh cho các thí nghiệm cảm nhiễm. Cảm ơn các Anh/Chị nghiên cứu sinh khóa 2012; sự hỗ trợ tích cực của các em học viên cao học: Huỳnh Thị Diễm Trang và Trần Tiến Lực và các em sinh viên: Đặng Phạm Hòa Hiệp, Trần Minh Khá, Hồ Văn To, Dương Thanh Quy, Lâm Cẩm Oanh, Bùi Thụy Hạnh Nguyên, Nguyễn Lâm Viên, Võ Trung Hiếu, Trần Quốc Hảo, Thị Mỹ Hạnh và Nguyễn Thị Hoa Đăng. Cuối cùng, sự thành công của luận án không thể không kể đến sự đóng góp không nhỏ của các thành viên trong gia đình, những người luôn ủng hộ, động viên và giúp tôi vượt qua rất nhiều khó khăn trong thời gian học tập. QUÁCH VĂN CAO THI ii TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định các đặc điểm bệnh học cảm nhiễm kép (coinfection/super infection/concurrent infection/dual infection hay mixed infection) và cơ chế đa kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra nuôi thâm canh ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL).

Bằng các kỹ thuật sinh hóa truyền thống (bao gồm bộ kít API 20E) và sinh học phân tử (PCR và giải trình tự gen), đề tài đã phân lập và định danh được 141 chủng vi khuẩn (gồm 67 chủng vi khuẩn E. ictaluri và 74 chủng vi khuẩn A. hydrophila) từ các mẫu cá tra bệnh gan thận mủ (GTM) và bệnh xuất huyết (XH). Trong số các chủng vi khuẩn phân lập được thì có 22/67 (chiếm 32,84%) chủng E.

ictaluri và 22/74 (chiếm 29,73%) chủng A. hydrophila có nguồn gốc từ cá tra nhiễm kép 2 loại bệnh này. Kết quả giải trình tự gen cho thấy các chủng vi khuẩn E. hydrophila phân lập có tỷ lệ tương đồng với các chủng vi khuẩn E.

hydrophila trên ngân hàng GenBank dao động từ 99-100% và 98-100%. Kết quả thí nghiệm xác định độc lực và khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. hydrophila với mật số tiêm vi khuẩn từ 102 đến 106 CFU/cá cho thấy cá tra sau khi cảm nhiễm có dấu hiệu biểu hiện bệnh đặc trưng của 2 loài vi khuẩn. Các đốm trắng nhỏ li ti xuất hiện trên các cơ quan như gan, thận và tỳ tạng của cá tra cảm nhiễm với vi khuẩn E.

ictaluri; trong khi đó các dấu hiệu của bệnh XH do vi khuẩn A. hydrophila gồm mắt lồi, các đốm XH xuất hiện quanh các vây, miệng, hậu môn và trong xoang bụng cá bệnh thường có dịch màu hồng. Qua kết quả thí nghiệm cũng đã xác định được độc lực và liều gây chết LD50 của 4 chủng vi khuẩn E. ictaluri 1ED3, 3ED3, 8ED3 và 10ED3 lần lượt là 1,58x104, 1,23x105, 1,67x104 và 1,19x105 CFU/mL, trong khi độc lực và liều gây chết LD50 của 4 chủng vi khuẩn A.

hydrophila 1A3, 2A3, 4A3 và 5A3 lần lượt là 1,47x104, 2,37x103, 1,29x103 và 1,52 x104 CFU/mL. Hai chủng 1ED3 và 4A3 có độc lực cao nhất trong thí nghiệm trên được chọn gây cảm nhiễm kép trên cá tra bằng phương pháp ngâm và tiêm. Kết quả thí nghiệm cho thấy việc cảm nhiễm kết hợp 2 chủng vi khuẩn này đã làm gia tăng độc lực gây bệnh của vi khuẩn. Bệnh bộc phát mạnh với tỷ lệ cá chết ở các nghiệm thức (NT) nhiễm kép (tỷ lệ cá chết tích lũy dao động từ 80% đến 93,33%) cao hơn có ý nghĩa thống kê (P< 0,05) so với phương pháp cảm nhiễm đơn.

Thời gian vi khuẩn gây cá chết trong NT ngâm kép là 12 giờ, sớm hơn so với NT ngâm đơn 2 chủng 1ED3 và 4A3 lần lượt là 96 giờ và 36 giờ. Cá nhiễm kép trong nghiên cứu có các dấu hiệu bệnh tương tự với các dấu hiệu bệnh của cá nhiễm kép ngoài tự nhiên và chủ yếu là các dấu hiệu kết hợp của 2 loại bệnh này. Cá nhiễm kép thường có các dấu hiệu như mắt lồi, các đốm XH xuất hiện quanh các vây, miệng, hậu môn, dịch màu hồng trong xoang bụng và các đốm trắng nhỏ li ti xuất hiện trên các cơ quan như gan, thận iii và tỳ tạng. Ngoài ra, kết quả nhuộm Haematoxylin và Eosin (H&E) cho thấy có sự biến đổi cấu trúc tế bào và vùng mô của các cơ quan như gan, thận và tỳ tạng với các hiện tượng thường xuất hiện như sung huyết, XH và hoại tử mất cấu trúc.

Tuy nhiên, cấu trúc tế bào và vùng mô ở các mẫu da-cơ và mang của cá nhiễm kép không hoặc ít bị biến đổi trong thời gian theo dõi thí nghiệm. Kết quả thực hiện kháng sinh đồ trên 67 chủng E. ictaluri và 74 chủng A. hydrophila cho thấy vi khuẩn E.

ictaluri đã kháng hầu hết các kháng sinh với tỷ lệ cao như chloramphenicol (94,03%), florfenicol (94,03%), tetracycline (92,54%), streptomycin (74,63%), enrofloxacin (71,64%), gentamicin (46,27%) và norfloxacin (46,27%). Trong khi đó, vi khuẩn A. hydrophila kháng hoàn toàn và kháng cao với với các kháng sinh như ampicillin (100%), amoxicillin (100%), cefalexin (100%), tetracycline (90,54%), florfenicol (60,81%) và neomycin (54,05%). Đặc biệt, qua kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn E.

hydrophila phân lập được đều thể hiện tính đa kháng với nhiều loại thuốc kháng sinh. Ngoài ra, kết quả luận án cũng cho thấy các chủng vi khuẩn E. hydrophila trong nghiên cứu thường xuyên tiếp xúc với kháng sinh trong môi trường nuôi cá tra với chỉ số đa kháng (MAR) ở các địa điểm thu mẫu đều lớn hơn 0,2. Nghiên cứu đã xác định các yếu tố di truyền liên quan đến cơ chế đa kháng thuốc của vi khuẩn như sự hiện diện của các integron nhóm 1 ở 2 loài vi khuẩn A.

ictaluri với tỷ lệ lần lượt là 51,35% và 35,82%. Sử dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen, luận án đã xác định nhiều vùng gen cassette mã hóa cho các enzyme dihydrofolate reductase, aminoglycoside adenyltransferase, aminoglycoside N(6')-acetyltransferase và β-lactamase kháng lại nhiều loại kháng sinh khác nhau ở 2 loài vi khuẩn A. Ngoài ra, sự hiện diện của các gen kháng tetracyline như tetA, tetB,, tetC, tetG, tetK và tetS đã được phát hiện ở 2 loài vi khuẩn A. ictaluri với tỷ lệ lần lượt là 82,5%, 8,75%, 31,25%, 33,75%, 8,75% và 7,5%; trong khi tần số xuất hiện các gen kháng florfenicol là 72,5% và 87,5%.

Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn A. ictaluri có khả năng truyền gen kháng thuốc của chúng sang vi khuẩn E. coli trong môi trường ao nuôi cá tra. Tuy nhiên, giữa các chủng vi khuẩn A.

ictaluri không có khả năng tiếp hợp và truyền gen kháng thuốc cho nhau. Từ khóa: Aeromonas hydrophila, cá tra, Edwardsiella ictaluri, integron, sự kháng thuốc. iv SUMMARY This study was carried out to determine the experimentally pathological characteristics of coinfected fish and identify the molecular elements related to mechanism of multiple antimicrobial resistance in E. hydrophila cause diseases on intensively cultured striped catfish in the Mekong Delta.

By using conventional biochemical tests (including the API 20E identification kit) and molecular biology techniques (PCR and gene sequencing), total of 141 strains of E. hydrophila from bacillary necrosis of Pangasius and hemorrhagic infected fish samples were isolated and identified. In which, there were 67 E. Among these, there were 22/67 (32.

hydrophila recovered from fish samples infected by both diseases. The gene sequencing results showed that the similarity of isolated bacterial sequence with the reference sequences in the GenBank ranged from 99 to 100% for E. ictaluri and from 98 to 100% for A. The virulence and pathogenicity of E.

hydrophila strains were evaluated by intraperitoneal injection with 0.1 mL/fish at bacterial densities from 102 to 106 CFU/fish. The results showed that the moribund fish displayed typical clinical signs of single bacterial infection. Tiny white spots appeared on internal organs such as livers, kidneys and spleens of fish exposed to E. Meanwhile, the exophthalmic eyes and petechial spots appeared around the fins, mouth, anus and pinkish fluid in abdominal cavity were also recorded in hemorrhagic disease infected fish by A.

The virulence and LD50 values of four strains of E.19x105 CFU/mL, respectively; while the virulence and LD50 values of four strains of A.52x104 CFU/mL, respectively.