Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn lactic ứng dụng lên men thức ăn thô xanh cho lợn

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTIC NHẰM ỨNG DỤNG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH CHO LỢN Giáo viên hướng dẫn: ThS. Vũ Thị Hạnh Nguyên Sinh viên : Phùng Thị Huệ Lớp : 1402 Hà Nội - 2018 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTIC NHẰM ỨNG DỤNG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH CHO LỢN Giáo viên hướng dẫn : ThS. Vũ Thị Hạnh Nguyên Sinh viên thực hiện : Phùng Thị Huệ Lớp : 1402 Hà Nội - 2018 Khóa luận tốt nghiệp CNSH 14-02 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu trong luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô và cán bộ phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt tới ThS.

Vũ Thị Hạnh Nguyên – cán bộ phòng Công nghệ lên men, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn PGS. Phí Quyết Tiến, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Công nghệ lên men đã tạo điều kiện để tôi được thực tập tại phòng Công nghệ lên men. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Và cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã giúp đỡ, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Phùng Thị Huệ Phùng Thị Huệ i Khóa luận tốt nghiệp CNSH 14-02 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.ii DANH MỤC CÁC BẢNG. vii DANH MỤC CÁC HÌNH.viii MỞ ĐẦU. Mục đích nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Thức ăn thô xanh dạng lỏng dùng cho chăn nuôi lợn. Vi sinh vật trong sản xuất thức ăn thô xanh dạng lỏng.

Tổng quan về probiotic. Lịch sử nghiên cứu probiotic. Thành phần và đặc điểm của vi sinh vật được sử dụng trong probiotic6 1. Vai trò của probiotic trong chăn nuôi.

Một số loài vi khuẩn lactic thường sử dụng trong chăn nuôi. Đánh giá hoạt tính probiotic của các chủng vi khuẩn lactic sử dụng trong lên men thức ăn thô xanh. Khả năng sinh acid lactic. Khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn.11 Phùng Thị Huệ ii Khóa luận tốt nghiệp CNSH 14-02 1.

Các hợp chất kháng khuẩn khác. Khả năng kháng kháng sinh. Khả năng chịu muối mật. Khả năng chịu pH acid.

Tình hình nghiên cứu và sử dụng các chủng vi khuẩn lactic trong lên men thức ăn thô xanh …………………………………………………………14 1. Tình hình nghiên cứu trong nước. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Vật liệu và hóa chất dùng trong nghiên cứu. Chủng giống vi sinh vật. Hóa chất và thiết bị. Môi trường nuôi cấy.

Phương pháp nghiên cứu. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh. Khả năng sinh acid lactic. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định.

Khả năng kháng kháng sinh. Khả năng chịu muối mật. Khả năng chịu pH acid.22 Phùng Thị Huệ iii Khóa luận tốt nghiệp CNSH 14-02 2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng được tuyển chọn.

Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào. Xác định khả năng sử dụng nguồn carbon, nito. Xác định khả năng chịu muối và dải nhiệt độ, pH thích hợp cho sinh trưởng của chủng vi khuẩn. Phân loại chủng vi sinh vật được tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử.

Tách chiết DNA tổng số. Khuếch đại gen 16S rDNA của chủng vi khuẩn. Phương pháp xử lý số liệu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh. Đánh giá khả năng sinh catalase và nhuộm Gram. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid tổng số. Khả năng sinh acid lactic.

Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định. Khả năng kháng kháng sinh. Khả năng chịu muối mật. Khả năng chịu pH acid.

Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn được tuyển chọn. Đặc điểm hình thái, tế bào. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa.39 Phùng Thị Huệ iv Khóa luận tốt nghiệp CNSH 14-02 3. Phân loại chủng vi khuẩn được tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử….

Khuếch đại gene 16S rDNA của chủng được tuyển chọn. Giải và phân tích trình tự gene 16S rDNA của chủng được tuyển chọn .41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.44 TÀI LIỆU THAM KHẢO.45 Phùng Thị Huệ v Khóa luận tốt nghiệp CNSH 14-02 DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ CTAB Cetyltrimethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid FLF Fermented Liquid Feed KS Kháng sinh LAB Lactic acid bacteria OD Mật độ quang rDNA Deoxyribonucleic acid ribosome SDS Sodium dodecyl sulfate TE Tris – EDTA VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật Phùng Thị Huệ vi Khóa luận tốt nghiệp CNSH 14-02 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Ảnh hưởng của probiotic lên vật nuôi. Khả năng sinh catalase và kết quả nhuộm Gram của các chủng vi khuẩn.

Đường kính vòng phân giải CaCO3 trên môi trường MRS (1% CaCO3) của một số chủng vi khuẩn đại diện. Hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn. Khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. Khả năng đồng hóa nguồn carbon, nito của chủng vi khuẩn LTX6 và LTX31.

Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ muối đến sinh trưởng của LTX6. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ muối đến sinh trưởng của LTX31. Phân tích trình tự gene 16S rDNA của chủng LTX31.42 Phùng Thị Huệ vii Khóa luận tốt nghiệp CNSH 14-02 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2. Đường chuẩn acid lactic.

Khuẩn lạc vi khuẩn lactic phân giải CaCO3 trên môi trường MRS. Phản ứng với thuốc thử Uphenmen của các chủng vi khuẩn. Hàm lượng acid lactic của các chủng vi khuẩn lactic. Khả năng kháng kháng sinh của một số chủng vi khuẩn đại diện.

Tỷ lệ (%) sống sót của các chủng vi khuẩn tại nồng độ muối mật 0,3% theo thời gian. Tỷ lệ (%) sống sót của các chủng vi khuẩn tại pH 2 theo thời gian. Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng LTX6 và LTX31. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gene 16S rDNA của chủng LTX31 trên gel agarose 1,0%.

Cây phát sinh chủng loại của chủng LTX31.43 Phùng Thị Huệ viii Khóa luận tốt nghiệp CNSH 14-02 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, chăn nuôi lợn là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn ở nước ta. Các sản phẩm của ngành chăn nuôi không những đã đáp ứng nguồn thực phẩm cho nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn xuất khẩu thu ngoại tệ cho kinh tế quốc dân. Trong chăn nuôi lợn, thức ăn chiếm tới 70% chi phí và là yếu tố chính quyết định chất lượng, giá thành sản phẩm.

Vì vậy việc chế biến và bảo quản thức ăn vô cùng quan trọng đối với ngành chăn nuôi. Từ xưa, thức ăn thô xanh đã đóng vai trò quan trọng đối với người chăn nuôi lợn. Tùy thuộc chủng loại nguyên liệu, thức ăn thô xanh có thể chứa hầu hết các chất dinh dưỡng mà vật nuôi cần như protein, các vitamin, khoáng đa lượng và vi lượng thiết yếu và các chất có hoạt tính sinh học cao. Ở Việt Nam, các nguồn thức ăn thô xanh rất phong phú như cỏ, rơm, rạ.

Để không lãng phí nguồn nguyên liệu này, người ta đã tìm ra biện pháp sử dụng chế phẩm sinh học để lên men thức ăn thô xanh kết hợp với phế phụ phẩm nông nghiệp để tạo thức ăn dạng lỏng cung cấp cho chăn nuôi lợn. Đây là một phương thức chăn nuôi hữu cơ - một giải pháp công nghệ phù hợp vì có nhiều ưu điểm vượt trội, đem lại hiệu quả về kinh tế (năng suất, chất lượng), xã hội (vệ sinh an toàn thực phẩm), môi trường (tận dụng hiệu quả nguồn tài nguyên sẵn có). Nhóm vi sinh vật chủ yếu sử dụng trong công nghệ trên gồm nấm men Saccharomyces cerevisiae, Bacillus spp. Trong đó, vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic do lên men đồng hình và dị hình, nó còn có thể sinh hàng loạt các hợp chất có hoạt tính kháng sinh được gọi chung là bacterioxin gồm nizin, diplocoxin, acidofilin, lactoxindin, lactolin, brevin,… Các chất này được sử dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, trong chăn nuôi với vai trò là chất kích thích sinh trưởng, ứng dụng trong việc phòng và trị các bệnh đường tiêu hóa cho người và vật nuôi.

Phùng Thị Huệ 1 Khóa luận tốt nghiệp CNSH 14-02 Từ đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn lactic nhằm ứng dụng lên men thức ăn thô xanh cho lợn”. Nghiên cứu này góp phần tìm kiếm các chủng vi khuẩn phù hợp có thể định hướng tạo chế phẩm sinh học lên men và bảo quản thức ăn thô xanh, tận thu phế phụ phẩm nông nghiệp nâng cao hiệu quả trong chăn nuôi và giảm ô nhiễm môi trường. Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại được chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính probiotic nhằm ứng dụng trong lên men thức ăn thô xanh cho lợn. Nội dung nghiên cứu - Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic phù hợp nhằm ứng dụng trong lên men thức ăn thô xanh cho lợn - Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn - Phân loại chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn Phùng Thị Huệ 2 Khóa luận tốt nghiệp CNSH 14-02 PHẦN 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Thức ăn thô xanh dạng lỏng dùng cho chăn nuôi lợn Thức ăn thô xanh dạng lỏng (Fermented Liquid Feed, FLF) là thức ăn đã được trộn với nước ở tỷ lệ khác nhau, từ 1: 1,5 đến 1: 4 (Missotten et al. Thức ăn thô xanh dạng lỏng có thể được sản xuất bằng cách lên men một hoặc một số loại nguyên liệu như hạt ngũ cốc, nguyên liệu giàu protein, nguyên liệu tổng hợp khác (bột đậu tương, bột cá, bột xương), sinh khối thực vật. và phối trộn thức ăn đã lên men này với các thành phần thức ăn không lên men khác để cung cấp thức ăn hoàn chỉnh cho lợn.