Luận án: Nghiên cứu đặc tính vi rút hoại tử thần kinh & kháng nguyên tái tổ hợp phòng bệnh cá mú

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện. Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thanh i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận án này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các tổ chức và cá nhân. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.

Phạm Công Hoạt (Bộ Khoa học và Công nghệ), PGS.TS Phạm Thị Tâm (Phòng Khoa học và Hợp tác quốc tế, Viện Đại học Mở Hà Nội) đã định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới sự hỗ trợ về tài chính, cơ sở vật chất, trang thiết bị từ đề tài cấp Nhà nước mã số KC04. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, kỹ thuật viên, học viên của Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội nơi tôi thực hiện các nội dung trong đề tài luận án, đã hỗ trợ về mọi mặt để tôi có thể hoàn thành luận án này. Để hoàn thành luận án này, tôi còn nhận được sự động viên, khuyến khích giúp đỡ của các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Tất cả những sự giúp đỡ và tình cảm quý báu đó là nguồn động lực lớn giúp tôi có thể hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thanh ii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt.

vii Danh mục bảng. ix Danh mục hình. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Một số đặc điểm sinh học của cá mú.

Hệ thống phân loại cá mú. Đặc điểm phân bố. Đặc điểm sinh trưởng. Đặc điểm sinh sản.

Đặc điểm về hệ miễn dịch ở cá mú. Ýnghĩa kinh tế và tình hình nuôi cá mú. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam10 1. Đặc điểm của bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển.

Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam. Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh trên cá. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh.

Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. Kháng nguyên tái tổ hợp và tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá27 1. Kháng nguyên tái tổ hợp của tác nhân gây bệnh. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá trên thế giới.

Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá tại Việt Nam. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Nhóm các phương pháp cho nội dung xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú .1 Phương pháp thu và xử lý mẫu .2 Phương pháp mô bệnh học. Phương pháp phân lập vi rút bằng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR).6 Điện di axit nucleic trên gel agarose .7 Phương pháp tách dòng gen:.

Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh (NNV). Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên tế bào GS1. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú .3 Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên tế bào GS1. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên cá mú.

Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp .1 Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen .2 Nối gen T4 vào vector pET32a+.3 Chuyển gen vào E. Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp chuẩn bị cho kiểm tra bằng PCR và enzyme giới hạn. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4.6 Phương pháp điện di SDS-PAGE. Phương pháp Western blot.

Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ hợp. Phương pháp xử lý số liệu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam.

Sàng lọc mẫu nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp mô bệnh học. Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp RT-PCR. Xác định vi rút gây bệnh trên tế bào. Giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên T4 của NNV.

Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào mẫn cảm72 3. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1.

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú. Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây hoại tử thần kinh85 3.1 Tạo chủng vi khuẩn E.coliBL21(DE3) mang gen mã hóa kháng nguyên của NNV.

Biểu hiện gen T4 trong tế bào vi khuẩn tái tổ hợp. Đánh giá các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp.

Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú. 100 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 104 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TIẾN SĨ.

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO. vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích aa Amino axit BFNNV Barfin flounder nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá bơn) bp Base pair (cặp bazơ) BSA Bovine Serum Albumin (Albumin huyết thanh bò) cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid (Chuỗi Axit Deoxyribonucleic acid bổ sung) CPE Cytopathogenic effect (Hiệu ứng bệnh tích tế bào) CNS Central nervous system (Hệ thần kinh trung ương) cs Cộng sự Da Dalton DAB Diamino bezidine (kit làm hiện màu) DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethyllene diamine tetra acetic acid ELISA Enzyme linked immunosorbent assay (phản ứng miễn dịch liên kết enzyme) EtBr Ethidium Bromide FCS fetal calf serum (Huyết thanh bào thai bê) HRP Horseradish peroxidase (Enzyme Horseradish Peroxidase) kb kilobase KDa Kilodalton GAA Global Aquaculture Alliance (Liên minh nuôi trồng thủy sản toàn cầu) GS Grouper spleen (tế bào lách cá mú) IPTG isopropyl β-D- thiogalactoside Ig Immunoglobulin (kháng thể) vii LB Leibovitz’s (môi trường nuôi tế bào) LD50 Lethal Dose 50% (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) NCR Non coding region ND Not done (không đánh giá) NNV Nervous Necrosis Virus (vi rút gây hoại tử thần kinh) nt nucleotid OD Optical Density (mật độ quang) ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở) PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di trên gel polyacrylamide) PCR Polemerase Chain Reaction (chuỗi phản ứng polime) PVDF Polyvinylidene Fluoride RGNNV Red - spotted grouper nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú chấm đỏ) RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse Transcription PCR (PCR phiên mã ngược) SDS Sodium dodecyl sulphase SJNNV Striped jack nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá măng sọc) TAE Tris - acetate - EDTA TBS Tris Buffer Saline TBST TBS - Tween TCID50 Tissue culture infective dose 50% (liều gây chết 50% tế bào) TPNNV Tiger puffer nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá nóc hổ) UV Ultraviolet light VLPs Virus-like particles (Tạo hạt giả vi rút) VNN Viral Nervous Necrosis (Bệnh hoại tử thần kinh) viii DANH MỤC BẢNG Thứ tự Tên bảng Trang bảng Vùng địa lý và sự phân bố một số loài cá mú có biểu hiện 1.1 13 bệnh hoại tử thần kinh 1.2 Các kiểu gen của Betanodavirus 23 1.3 Thuận lợi và tồn tại của vắc-xin DNA 33 1.4 Một số vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú 34 3.1 Kiểm tra vi rút bằng phương pháp mô bệnh học 58 Kiểm tra vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp 3.3 Xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1 65 So sánh mức độ đồng nhất của trình tự đoạn gen T4 thu được 3.4 70 với các trình tự của GenBank Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào 3.6 Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú 74 3.7 Phát hiện gen mã hoá kháng nguyên T4 của NNV trên cá mú 75 Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở nhiệt độ 28oC cả 3.8 78 ngày và đêm Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở 28oC ban ngày và 3.9 79 24oC ban đêm Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần 3.10 97 kinh ở mô hình in vitro Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần 3.11 99 kinh ở mô hình in vivo Hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch của cá mú chống lại NNV 3.12 101 trên mô hình in vitro ix DANH MỤC HÌNH Thứ tự Tên hình Trang hình 1.1 Hình thái ngoài cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides) 4 1.2 Sản lượng cá mú nuôi ở một số quốc gia trên thế giới 8 1.3 Dấu hiệu bệnh lý của cá mú bị VNN 11 1.4 Cấu trúc không gian của Betanodavirus 22 1.5 Cấu trúc gen của Betanodavirus 22 2.1 Quy trình thực hiện phương pháp mô bệnh học 39 Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây 2.2 47 nhiễm của vi rút trên tế bào Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây 2.3 48 nhiễm của vi rút trên cá mú 3.1 Bệnh tích tế bào ở mô não và mô mắt cá 57 Điện di đồ sản phẩm RT-PCR của một số mẫu bệnh phẩm 3.2 61 nghi nhiễm NNV 3.