Luận văn: Tổng hợp Rhamnetin-3-O-Rhamnoside ở E. coli cải biến di truyền - Phạm Thị Uyên

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ UYÊN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT RHAMNETIN-3-O-RHAMNOSIDE Ở VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI CẢI BIẾN DI TRUYỀN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Huy Thuần TS. Nguyễn Xuân Cảnh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Phạm Thị Uyên i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Công nghệ Sinh học đã quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Huy Thuần (hướng dẫn khoa học 1) và TS. Nguyễn Xuân Cảnh (hướng dẫn khoa học 2), những người đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô và kỹ thuật viên tại Trung tâm sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển công nghệ cao, Đại Học Duy Tân bao gồm TS. Nguyễn Minh Hùng, TS. Nguyễn Thành Trung, TS. Nguyễn Thị Hà, TS.

Lê Thành Đô, TS. Hồ Viết Hiếu, TS. Trần Thị Thanh Thỏa và cử nhân Đặng Thị Kim Mai đã tạo điều kiện cho tôi được sử dụng các trang thiết bị để tiến hành thí nghiệm. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới bạn Võ Trần Khánh Huyền - học viên cao học tại Trung tâm Sinh học Phân tử, em Nguyễn Hồng Phong, sinh viên K19 khoa Dược – Đại học Duy Tân, đã tham gia trao đổi với tôi về các vấn đề thực hành thí nghiệm.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Ban lãnh đạo trường Đại học Duy Tân, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, cùng tập thể cán bộ, công nhân viên, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè, những người luôn tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu cũng như hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Phạm Thị Uyên ii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục.

iii Danh mục chữ viết tắt. v Danh mục bảng. vi Danh mục hình, hiểu đồ. vii Thesis abstract.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu.

Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu .Tổng quan tài liệu. Khái quát về flavonoid. Giới thiệu rhamnetin và một số dẫn xuất rhamnetin glycoside thường gặp.

Con đường sinh tổng hợp rhamnetin và dẫn xuất rhamnetin-3-o-rhamnoside ở thực vật. Một số phương pháp nghiên cứu tổng hợp rhamnetin và dẫn xuất rhamnetin glycoside. Vai trò của các enzyme. Một số phương pháp tổng hợp rhamnetin.

Các hoạt tính sinh học của rhamnetin. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Nguyên vật liệu. Phương pháp nghiên cứu. Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside.

Ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Ảnh hưởng của nồng độ iptg tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Kết quả và thảo luận.

Kết quả thí nghiệm tổng hợp và phát hiện rhamnetin-3-o-rhamnoside. Kết quả nghiên cứu bổ sung cơ chất rhamnetin và tách chiết thu sản phẩm. Phân tích kết quả chuyển hóa bằng sắc ký bản mỏng. Phân tích kết quả chuyển hóa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc).

Phân tích kết quả chuyển hóa bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ. Đánh giá và bàn luận ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy tới hiệu suất sinh tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Ảnh hưởng của nồng độ iptg tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside.

Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. Kết luận và kiến nghị. 41 Tài liệu tham khảo. 42 iv DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ 4CC 4-coumaroyl-CoA 4CL 4-coumaroyl-CoA ligase C4H Cinnamic 4-hydroxylase CHI Chalcone isomerase CHS Chalcone synthase CPR cytochrome P450 reductase DMSO Dimethyl sulfoxide F3H Flavone 3β-hydroxylase F3GT Flavonol 3-O-glycosyltransferase FLS Flavonol synthase GT Glycosyltransferase HPLC High-performance liquid chromatography IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside KLPT Khối lượng phân tử LB Lysogeny broth LC-ESI-MS/MS Liquid Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometric NDP nucleotide diphosphate OD Optical density OMT O-methyltransferase PAL phenylalanine amoniac lyase TAL Tyrosine amoniac lyase TB Terrific Broth TDP Thymidine diphosphate TLC Thin layer chromatography UDP Uridine diphosphate UGT Uridine diphosphate glycosyltransferase v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.

Phân loại một số lớp flavonoid thường gặp ở thực vật. Một số hoạt tính sinh học của rhamnetin. Thành phần môi trường TB. Thành phần môi trường LB.

Thành phần các dung dịch gốc dùng để pha môi trường M9. Thành phần môi trường M9. Kết quả đo thử nghiệm hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside ở các môi trường nuôi cấy khác nhau. Kết quả đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside tại các nồng độ IPTG khác nhau.

Kết quả đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside tại các mức nhiệt độ khác nhau. So sánh hiệu quả chuyển hóa một số loại cơ chất với rhamnetin. 40 vi DANH MỤC HÌNH, HIỂU ĐỒ Hình 2. Phân loại flavonoid dựa vào gốc aryl (vòng B).

Các cấu trúc khung cơ bản của một số nhóm flavonoid thường gặp. Phân bố của rhamnetin ở một số loài thực vật. Rhamnetin và một số dẫn xuất của chúng. Tổng hợp rhamnetin glycoside ở thực vật.

Cơ chế phản ứng của enzyme glycosyltransferases, (A). Sản xuất rhamnetin từ quercetin thông qua enzyme POMT7. coli tái tổ hợp. Sơ đồ chuyển hóa tạo sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside.

Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside. Sản phẩm sau khi tinh sạch và đông khô. Sắc ký đồ phân tích vị trí của cơ chất rhamnetin và rhamnetin glycoside. Phân tích định tính sự tạo thành rhamnetin-3-O-rhamnoside.

Phân tích LC-ESI-MS/MS ở chế độ negative mode. Sơ đồ phân mảnh MS/MS của rhamnetin rhamnoside. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3- O-rhamnoside. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ IPTG tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin- 3-O-rhamnoside.

Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O- rhamnoside. 37 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phạm Thị Uyên Tên luận văn: “Nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền”. Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 02 01 Cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Thiết lập quy trình sinh tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi khuẩn E. coli cải biến di truyền và đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy để tối ưu hóa sản xuất hợp chất này.

Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh nuôi cấy vi khuẩn E. coli trên đĩa thạch và trong ống nghiệm có sử dụng kháng sinh với nồng độ phù hợp Tách chiết hoạt chất rhamnetin glycoside bằng phương pháp chiết pha lỏng-pha lỏng sử dụng ethylacetate làm dung môi. Đông khô mẫu trên máy sấy thăng hoa. Định tính và định lượng bằng phương pháp TLC, HPLC, LC-ESI-MS/MS.

Kết quả chính và kết luận Việc tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside dựa trên E. coli tái tổ hợp có tính khả thi và sản phẩm tạo thành được kiểm tra bằng các phương pháp như TLC, HPLC, LC-ESI-MS/MS. Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới nuôi cấy và chuyển hóa cơ chất như chủng loại môi trường, nồng độ IPTG và nhiệt độ đã thu được sản lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside cao nhất đạt 12. Tìm hiểu, đánh giá tầm quan trọng của các sản phẩm flavonoid glycoside nói chung và rhamnetin nói riêng trong các lĩnh vực y dược, mỹ phẩm, v.

xây dựng cơ sở cho các nghiên cứu phục vụ nhu cầu thực tiễn tạo các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên và có giá trị cao trong đời sống. viii THESIS ABSTRACT Master candidate: Pham Thi Uyen Thesis title: “Study on the biosynthesis of the bioactive rhamnetin-3-O-rhamnoside in genetically modified Escherichia coli” Major: Biotechnology Code: 60 42 0201 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives: Investigation the biosynthesis of rhamnnetin-3-O-rhamnoside using genetically engineered E. coli by supplementation of methylated flavonol, rhamnetin, and evaluating the effect of culture conditions (medium, IPTG concentration and temperature) to improve the production of target compounds. Materials and Methods: Recombinant E.

coli was cultured in broth medium using antibiotics (streptomycin, kanamycin and chloramphenicol) at appropriate concentrations. Rhamnetin was supplemented into culture broth as substrate and the culture was mainted to proceed whole cell bioconversion to produce rhamnetin-3-O-rhamnoside. Extraction of rhamnetin glycoside was carried out by liquid-liquid extraction using ethylacetate as solvent. Crude extract was obtained by the vacuum rotary drier.

The formation of product was confirmed by chromatographical methods such as TLC, HPLC, LC-ESI-MS / MS. Culture conditions such as type of medium, IPTG concentration and temperature those effect to bacterial growth were screened to improve yield of rhamnetin-3-O-rhamnoside. Main findings and conclusions The recombinant E. coli was proved to produce rhamnetin-3-O-rhamnoside by TLC, HPLC and LC-ESI-MS/MS data.

Effect of culture medium, IPTG and temperature was investigated and resulted in TB, 0.8 mM IPTG and 32ºC are the best parameters to enhance the production. The highest yield of rhamnetin-3-O-rhamnoside was 12. Understanding and evaluating the importance of flavonoid glycoside as well as and rhamnetin in particular in the fields of medicine, cosmetics, etc. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Rhamnetin là một flavonoid thuộc nhóm flavonol, có vị trí methyl hóa ở carbon số 7 (C7).

Rhamnetin và dẫn xuất rhamnetin glycoside đã được chứng minh có một số hoạt tính sinh học mạnh như kháng viêm, kháng khuẩn, ức chế khối u rất mạnh. Tuy nhiên, việc chiết xuất rhamnetin glycoside từ thực vật gặp nhiều khó khăn do chúng có hàm lượng thấp, dễ lẫn tạp nên đòi hỏi nhiều kỹ thuật và thời gian thực hiện. Ngoài ra, việc tổng hợp chất này theo phương pháp hóa hữu cơ cũng có hạn chế do tính tương tác không đặc hiệu của nhóm chức hóa học theo mong muốn, điều kiện phản ứng và kỹ thuật tinh sạch phức tạp.