Nghiên cứu tăng cường tính kháng bệnh bạc lá trên lúa TBR225 - Trần Lan Đài
Tăng cường kháng bệnh bạc lá cho giống lúa tbr225 qua công nghệ CRISPR-Cas9. Mục tiêu là nâng cao khả năng chống chịu, cải thiện năng suất cây trồng.
Đại học Quốc gia Hà Nội
Công nghệ sinh học
Luan An
Luận án Tiến sĩ
Năm xuất bản
Số trang
172
Thời gian đọc
26 phút
Lượt xem
0
Lượt tải
0
Phí lưu trữ
50 Point
Mục lục chi tiết
Tóm tắt nội dung
I. Giới thiệu nghiên cứu tăng cường kháng bệnh bạc lá lúa TBR225 bằng CRISPR Cas9
Nghiên cứu này tập trung vào việc tăng cường tính kháng bệnh bạc lá trên giống lúa TBR225. Đây là giống lúa phổ biến tại Việt Nam. Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra. Bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho sản xuất lúa gạo. Công nghệ CRISPR/Cas9 được ứng dụng để chỉnh sửa gen kháng bệnh. Mục tiêu là tạo dòng lúa kháng bệnh hiệu quả hơn. Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. Luận án thuộc chuyên ngành Công nghệ sinh học. Nghiên cứu kế thừa dự án về chọn tạo giống lúa chống chịu sâu bệnh. Công trình sử dụng phương pháp chỉnh sửa hệ gen tiên tiến. Kết quả có ý nghĩa lớn cho nông nghiệp Việt Nam.
1.1. Mục tiêu nghiên cứu chỉnh sửa gen lúa TBR225
Mục tiêu chính là tăng cường tính kháng bệnh bạc lá trên giống lúa TBR225. Nghiên cứu sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa promoter gen SWEET. Cụ thể là chỉnh sửa các gen OsSWEET13 và OsSWEET14. Đây là các gen nhiễm bệnh mà vi khuẩn Xoo nhắm đến. Việc chỉnh sửa nhằm ngăn chặn sự hoạt hóa của TAL effector từ vi khuẩn. Từ đó làm giảm khả năng gây bệnh của Xoo trên lúa. Nghiên cứu cũng phân lập và nghiên cứu cơ chế gây bệnh của quần thể Xoo ở phía Bắc Việt Nam. Đồng thời thiết kế hệ thống chỉnh sửa đa gen hiệu quả.
1.2. Ý nghĩa của nghiên cứu biến đổi gen cây trồng kháng bạc lá
Nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn. Về mặt khoa học, nghiên cứu làm rõ cơ chế tương tác phân tử giữa lúa và vi khuẩn Xoo. Nghiên cứu cung cấp hiểu biết mới về vai trò của gen SWEET trong bệnh bạc lá lúa. Về mặt thực tiễn, kết quả giúp tạo giống lúa kháng bệnh mới. Giống lúa kháng bệnh giảm thiểu thiệt hại cho nông dân. Giảm sử dụng thuốc bảo vệ thực vật. Bảo vệ môi trường và sức khỏe con người. Nghiên cứu góp phần phát triển nông nghiệp bền vững tại Việt Nam. Công nghệ CRISPR/Cas9 mở ra hướng đi mới trong chọn tạo giống cây trồng.
II. Bệnh bạc lá lúa Nguyên nhân và cơ chế gây hại của vi khuẩn Xoo
Bệnh bạc lá lúa là một trong những bệnh nguy hiểm nhất trên cây lúa. Bệnh do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra. Vi khuẩn xâm nhập qua vết thương hoặc lỗ khí khổng lá. Bệnh lây lan nhanh trong điều kiện nhiệt đới ẩm ướt. Tại Việt Nam, bệnh gây thiệt hại nặng ở vùng Đồng bằng sông Hồng và sông Cửu Long. Nghiên cứu phân lập Xoo từ một số tỉnh phía Bắc Việt Nam đã được thực hiện. Quần thể vi khuẩn Xoo có sự đa dạng di truyền cao. Điều này đặt ra thách thức lớn cho công tác chọn tạo giống kháng. Hiểu biết cơ chế gây bệnh là nền tảng để phát triển biện pháp phòng trừ hiệu quả. Gen kháng bệnh và gen SWEET đóng vai trò quan trọng trong tương tác lúa-Xoo.
2.1. Đặc điểm vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) là vi khuẩn gram âm. Vi khuẩn thuộc họ Xanthomonadaceae. Xoo có dạng hình que, di động bằng roi. Nhiệt độ tối ưu cho phát triển là 25-30°C. Vi khuẩn tồn tại trong hạt giống và tàn dư cây bệnh. Xoo sản xuất nhiều yếu tố độc lực. Trong đó, TAL effectors (Transcription Activator-Like effectors) là yếu tố quan trọng nhất. TAL effectors xâm nhập vào tế bào thực vật. Chúng liên kết với promoter gen SWEET để kích hoạt biểu hiện. Từ đó tạo đường cho vi khuẩn hấp thụ đường. Nghiên cứu phân tích TALome của vi khuẩn Xoo giúp hiểu rõ đa dạng TAL effector.
2.2. Triệu chứng và thiệt hại do bệnh bạc lá lúa gây ra
Triệu chứng bệnh bạc lá xuất hiện trên lá lúa. Ban đầu là các vết bệnh nhỏ màu xám xanh. Sau đó lan rộng thành sọc dài dọc theo gân lá. Vết bệnh chuyển màu vàng rồi bạc trắng. Lá bị bệnh khô héo và chết. Bệnh nặng có thể gây cháy bông. Thiệt hại năng suất có thể lên đến 50-70%. Trong điều kiện dịch bệnh mạnh, thiệt hại có thể đạt 100%. Bệnh ảnh hưởng nghiêm trọng đến an ninh lương thực. Đặc biệt ở các vùng trồng lúa trọng điểm tại Việt Nam. Giống lúa TBR225 cũng chịu ảnh hưởng lớn từ bệnh này.
2.3. Các gen QTL liên quan đến tính kháng bệnh bạc lá lúa
Nhiều gen kháng bệnh bạc lá đã được xác định. Các gen kháng Xa bao gồm: Xa1, Xa4, xa5, xa13, Xa21. Mỗi gen có cơ chế kháng khác nhau. Xa1 kháng dựa trên phản ứng quá mẫn. Xa4 cung cấp kháng phổ rộng. xa5 là gen kháng lặn. xa13 kháng một chủng Xoo cụ thể. Xa21 là gen kháng phổ rộng đầu tiên được nhân dòng. Tuy nhiên, vi khuẩn Xoo có thể vượt qua hàng rào kháng bệnh. TAL effector của vi khuẩn đột biến để né tránh nhận biết. Do đó cần kết hợp nhiều gen kháng. Chỉnh sửa gen SWEET là hướng tiếp cận mới hiệu quả.
III. Vai trò của gen SWEET và TAL effector trong tương tác lúa vi khuẩn Xoo
Gen SWEET đóng vai trò trung tâm trong tương tác lúa-Xoo. SWEET là viết tắt của Sugars Will Eventually be Exported Transporters. Đây là nhóm protein vận chuyển đường trong tế bào thực vật. Vi khuẩn Xoo sử dụng TAL effector để điều khiển gen SWEET. TAL effector là protein tiết ra từ vi khuẩn. Chúng xâm nhập vào nhân tế bào thực vật. TAL effector liên kết với vùng promoter của gen SWEET. Điều này kích hoạt biểu hiện gen SWEET quá mức. Kết quả là đường được xuất ra ngoài tế bào. Vi khuẩn sử dụng đường này để phát triển. Hiểu biết cơ chế này giúp thiết kế chiến lược chỉnh sửa gen hiệu quả. Nghiên cứu tập trung vào OsSWEET11, OsSWEET13, OsSWEET14.
3.1. Họ gen SWEET ở cây lúa và chức năng sinh lý
Họ gen SWEET ở lúa gồm 21 thành viên. Chúng được phân thành 4 nhóm phylogenetic. Các gen SWEET vận chuyển đường sucrose, glucose hoặc fructose. OsSWEET11 biểu hiện mạnh ở lá và hạt. OsSWEET13 biểu hiện ở nhiều mô. OsSWEET14 biểu hiện ở lá non và bông. Các gen này tham gia quá trình phân phối đường trong cây. Vai trò bình thường là vận chuyển đường cho sự phát triển. Tuy nhiên, vi khuẩn Xoo lợi dụng gen SWEET gây bệnh. OsSWEET11, OsSWEET13, OsSWEET14 là đích của TAL effector. Chỉnh sửa promoter các gen này giúp tăng cường kháng bệnh.
3.2. Cơ chế tương tác đặc hiệu giữa TAL effector và gen SWEET
TAL effector có cấu trúc đặc biệt. Chúng chứa các tandem repeat 34-35 amino acid. Mỗi repeat nhận biết một nucleotide cụ thể. Mã code TAL effector-Nucleotide đã được giải mã. TAL effector liên kết với vùng EBE (Effector Binding Element) trong promoter gen SWEET. Mỗi chủng Xoo có bộ TAL effector khác nhau. Một số TAL effector hoạt hóa OsSWEET11. Số khác hoạt hóa OsSWEET13 hoặc OsSWEET14. Đột biến trong vùng EBE ngăn chặn liên kết TAL effector. Đây là cơ sở cho chiến lược chỉnh sửa promoter SWEET. Phương pháp này giúp lúa kháng bệnh mà không ảnh hưởng sinh lý bình thường.
3.3. Các gen nhiễm OsSWEET liên quan đến bệnh bạc lá lúa TBR225
Nghiên cứu đã xác định gen SWEET nhiễm bệnh trên lúa TBR225. OsSWEET13 và OsSWEET14 là hai gen nhiễm chính. TAL effector từ Xoo liên kết với promoter OsSWEET13. Vùng liên kết được gọi là SW13-TBR. Tương tự, OsSWEET14 bị hoạt hóa qua vùng SW14-TBR. Phân tích trình tự promoter giúp xác định vị trí đột biến tối ưu. Đột biến trong vùng EBE ngăn cản liên kết TAL effector. Từ đó ngăn chặn biểu hiện quá mức của gen SWEET. Kết quả là vi khuẩn không thể hấp thụ đường. Lúa TBR225 trở nên kháng bệnh bạc lá. Đây là chiến lược chỉnh sửa gen kháng bệnh hiệu quả.
IV. Hệ thống CRISPR Cas9 trong chỉnh sửa gen cây trồng kháng bệnh bạc lá
CRISPR/Cas9 là công nghệ chỉnh sửa gen mạnh mẽ. Công nghệ cho phép cắt DNA tại vị trí mục tiêu chính xác. Hệ thống gồm protein Cas9 và RNA hướng dẫn (sgRNA). Cas9 là enzyme cắt DNA. sgRNA dẫn Cas9 đến vị trí đích trên DNA. Tại vị trí đích, Cas9 tạo vết cắt đôi. Hệ thống sửa chữa DNA hoạt động để sửa vết cắt. Quá trình này tạo ra đột biến tại vị trí mục tiêu. CRISPR/Cas9 được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu cây trồng. Trong nghiên cứu này, CRISPR/Cas9 được dùng để chỉnh sửa promoter gen SWEET. Phương pháp này giúp tạo cây lúa kháng bệnh bạc lá. Công nghệ có ưu điểm: chính xác, hiệu quả, chi phí thấp.
4.1. Nguyên lý hoạt động của hệ thống CRISPR Cas9
Hệ thống CRISPR/Cas9 bắt nguồn từ hệ miễn dịch vi khuẩn. Ở vi khuẩn, CRISPR giúp chống lại virus. Protein Cas9 nhận diện và cắt DNA ngoại lai. sgRNA chứa trình tự bổ sung với DNA mục tiêu. sgRNA dài khoảng 20 nucleotide. Phần PAM (Protospacer Adjacent Motif) là tín hiệu nhận biết. Cas9 chỉ cắt khi có PAM ở vị trí phù hợp. Sau khi cắt, hệ thống NHEJ sửa chữa DNA. NHEJ thường tạo ra insertion hoặc deletion. Đột biến này phá hủy chức năng gen mục tiêu. Trong nghiên cứu này, mục tiêu là vùng promoter gen SWEET. Đột biến ngăn chặn liên kết TAL effector.
4.2. Thiết kế sgRNA chỉnh sửa promoter OsSWEET trong nghiên cứu
Thiết kế sgRNA là bước quan trọng trong nghiên cứu. sgRNA phải có tính đặc hiệu cao. Tránh hiện tượng off-target trên genome. Nghiên cứu thiết kế sgRNA nhắm vào vùng EBE của OsSWEET13 và OsSWEET14. sgRNA nhắm vào SW13-TBR và SW14-TBR. Vùng EBE là đích liên kết của TAL effector. Đột biến trong EBE ngăn chặn hoạt hóa gen SWEET. Hệ thống CRISPR/Cas9 chỉnh sửa đa gen được thiết kế. Cho phép chỉnh sửa đồng thời OsSWEET13 và OsSWEET14. Cấu trúc vector biểu hiện chứa nhiều sgRNA. Điều này tăng hiệu quả chỉnh sửa và kháng bệnh.
4.3. Xây dựng vector biểu hiện cấu trúc T DNA chỉnh sửa gen SWEET
Vector biểu hiện là công cụ chuyển gen vào lúa. Cấu trúc T-DNA chứa các thành phần cần thiết. Promoter mạnh điều khiển biểu hiện Cas9. sgRNA được đặt dưới promoter U6 hoặc U3. Kháng sinh marker giúp tuyển chọn cây chuyển gen. Nghiên cứu thiết kế vector mang cấu trúc chỉnh sửa SW14-TBR. Vector thứ hai chỉnh sửa cả SW13-TBR và SW14-TBR. Quá trình nhân dòng được thực hiện bằng enzyme giới hạn. Vector được chuyển vào Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium là trung gian chuyển T-DNA vào tế bào lúa. Cấu trúc T-DNA tích hợp vào genome lúa. Từ đó tạo cây lúa chỉnh sửa gen.
V. Kết quả tạo dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen kháng bệnh bạc lá bằng CRISPR Cas9
Nghiên cứu đã tạo thành công dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen. Quy trình chuyển gen qua Agrobacterium được tối ưu. Cây lúa tái sinh được phân tích kiểu gen. Kết quả cho thấy đột biến chính xác tại vị trí mục tiêu. Các dòng lúa chỉnh sửa SW14-TBR và SW13-TBR đã được tạo. Kiểm tra kiểu hình ở các thế hệ T1 và T2. Dòng lúa chỉnh sửa gen cho thấy kháng bệnh tốt hơn. Không có khác biệt đáng kể về đặc điểm nông học. Năng suất và chất lượng hạt được duy trì. Đây là kết quả quan trọng cho ứng dụng thực tiễn. Công nghệ CRISPR/Cas9 tỏ ra hiệu quả trên lúa TBR225. Kết quả mở ra triển vọng chọn tạo giống lúa kháng bệnh mới.
5.1. Tối ưu quy trình chuyển gen vào lúa TBR225 qua Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens là trung gian chuyển gen phổ biến. Quy trình chuyển gen cần tối ưu nhiều yếu tố. Chủng Agrobacterium phù hợp được lựa chọn. Điều kiện nuôi cấy mô lúa được tối ưu. Thời gian đồng nhiễm với Agrobacterium được điều chỉnh. Nồng độ kháng sinh tuyển chọn được xác định. Tỷ lệ chuyển gen thành công được cải thiện. Lúa TBR225 có đặc điểm sinh lý riêng. Do đó cần điều kiện nuôi cấy phù hợp. Quy trình tối ưu giúp tăng hiệu suất tái sinh cây lúa. Số lượng cây chuyển gen đạt yêu cầu nghiên cứu. Kết quả là tiền đề cho tạo dòng chỉnh sửa gen quy mô lớn.
5.2. Phân tích kiểu gen dòng lúa TBR225 chỉnh sửa SW14 TBR
Phân tích kiểu gen xác nhận đột biến tại SW14-TBR. Phương pháp PCR và giải trình tự DNA được sử dụng. Kết quả cho thấy deletion hoặc insertion tại vị trí mục tiêu. Đột biến xảy ra ở vùng EBE của promoter OsSWEET14. Một số cây có đột biến đồng bội (biallelic mutation). Số khác có đột biến dị hợp (heterozygous mutation). Kiểm tra off-target cho thấy không có đột biến ngoài ý muốn. Tính đặc hiệu của sgRNA được đảm bảo. Cây T0 được trồng để thu hạt T1. Kiểm tra di truyền đột biến qua các thế hệ. Đột biến di truyền ổn định theo Mendel. Kết quả xác nhận hiệu quả chỉnh sửa gen.
5.3. Đánh giá kiểu hình và kháng bệnh dòng lúa chỉnh sửa gen T1 T2
Dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen được đánh giá kiểu hình. Các đặc điểm nông học bao gồm: chiều cao cây, số nhánh, thời gian sinh trưởng. Kết quả cho thấy không có khác biệt lớn so với cây đối chứng. Đột biến trong promoter OsSWEET14 không ảnh hưởng sinh trưởng. Kiểm tra kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo với Xoo. Dòng chỉnh sửa gen cho thấy vết bệnh ngắn hơn. Mức độ kháng bệnh tăng đáng kể so với cây đối chứng. Ở thế hệ T2, kháng bệnh ổn định qua các dòng. Kết quả chứng minh hiệu quả của chỉnh sửa promoter SWEET. Phương pháp này an toàn cho đặc điểm nông học của lúa TBR225.
VI. Triển vọng ứng dụng công nghệ CRISPR Cas9 trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá
Nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của CRISPR/Cas9 trong tăng cường kháng bệnh bạc lá trên lúa TBR225. Kết quả mở ra triển vọng lớn cho ứng dụng thực tiễn. Công nghệ chỉnh sửa gen có thể áp dụng cho nhiều giống lúa khác nhau. Chiến lược chỉnh sửa promoter SWEET có tính tổng quát cao. Tuy nhiên, cần đánh giá thêm về an toàn sinh học. Quy định pháp luật về biến đổi gen cây trồng cần được tuân thủ. Nghiên cứu đóng góp vào nền khoa học chỉnh sửa gen cây trồng tại Việt Nam. Hướng phát triển tiếp theo bao gồm kết hợp nhiều gen kháng. Tạo giống lúa kháng phổ rộng với nhiều chủng Xoo khác nhau. Công nghệ CRISPR/Cas9 là công cụ mạnh mẽ cho nông nghiệp bền vững.
6.1. Ưu điểm của chỉnh sửa gen SWEET so với phương pháp truyền thống
Chỉnh sửa gen SWEET có nhiều ưu điểm vượt trội. So với phương pháp lai tạo truyền thống, tiết kiệm thời gian. Chỉ cần 2-3 năm thay vì 8-10 năm. Độ chính xác cao, chỉ thay đổi nucleotide mục tiêu. Không引入 DNA ngoại lai vào genome cây trồng. Giữ nguyên nền di truyền của giống lúa ban đầu. TBR225 giữ được đặc điểm nông học优良. Phương pháp này khác với biến đổi gen cây trồng truyền thống. Không sử dụng gen kháng kháng sinh làm marker thường trực. Đột biến tương tự đột biến tự nhiên. Dễ được chấp nhận hơn về mặt quy định. Chi phí nghiên cứu hợp lý hơn so với phương pháp khác.
6.2. Thách thức và hướng phát triển tiếp theo
Một số thách thức cần giải quyết. Tính kháng phổ rộng với nhiều chủng Xoo chưa hoàn thiện. Cần kết hợp chỉnh sửa OsSWEET11, OsSWEET13, OsSWEET14. Đánh giá lâu dài về tính ổn định của đột biến. Nghiên cứu ảnh hưởng trong điều kiện đồng ruộng thực tế. Xử lý quy định pháp luật về cây chỉnh sửa gen. Hướng phát triển tiếp theo bao gồm nhiều chiến lược. Sử dụng base editing để thay đổi nucleotide chính xác hơn. Kết hợp chỉnh sửa gen SWEET với gen kháng Xa. Tạo giống lúa kháng đa chủng Xoo. Phát triển giống lúa phù hợp với nhiều vùng sinh thái. Đào tạo nguồn nhân lực về công nghệ chỉnh sửa gen.
6.3. Ý nghĩa của nghiên cứu cho nông nghiệp Việt Nam
Nghiên cứu có ý nghĩa lớn cho nông nghiệp Việt Nam. Việt Nam là quốc gia xuất khẩu lúa gạo hàng đầu. Bệnh bạc lá gây thiệt hại hàng nghìn tỷ đồng mỗi năm. Giống lúa TBR225 kháng bệnh giúp giảm thiệt hại. Năng suất và chất lượng lúa được cải thiện. Giảm sử dụng thuốc bảo vệ thực vật. Bảo vệ môi trường và sức khỏe nông dân. Nghiên cứu đặt nền móng cho công nghệ chọn tạo giống mới. Xây dựng năng lực nghiên cứu chỉnh sửa gen tại Việt Nam. Đào tạo nhà khoa học trẻ trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Góp phần đảm bảo an ninh lương thực quốc gia. Phát triển nông nghiệp bền vững trong bối cảnh biến đổi khí hậu.
Tải xuống file đầy đủ để xem toàn bộ nội dung
Tải đầy đủ (172 trang)Trích đoạn nội dung luận án
Tải xuống để đọc toàn bộĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN VI SINH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRẦN LAN ĐÀI NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ TRÊN GIỐNG LÚA TBR225 BẰNG CÔNG NGHỆ CRISPR/Cas9 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN VI SINH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRẦN LAN ĐÀI NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ TRÊN GIỐNG LÚA TBR225 BẰNG CÔNG NGHỆ CRISPR/Cas9 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 9420201.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Phạm Xuân Hội 2. Nguyễn Duy Phƣơng Hà Nội – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của các Thầy hƣớng dẫn, kế thừa Dự án: “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chỉ thị phân tử và chỉnh sửa hệ gen trong chọn tạo giống lúa năng suất, chất lƣợng, chống chịu sâu bệnh và bất lợi ngoại cảnh”. Các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận án đã đƣợc cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Hà Nội, ngày 28 tháng 8 năm 2023 Nghiên cứu sinh Trần Lan Đài LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới GS. Phạm Xuân Hội và TS.
Nguyễn Duy Phƣơng là những ngƣời thầy đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, anh, chị, em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp đã nhiệt tình hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong thời gian nghiên cứu tại Bộ môn. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Hoàng Văn Vinh và TS.
Nguyễn Huỳnh Minh Quyên cùng các thầy, cô giáo tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong thời gian tôi học tập tại Viện cũng nhƣ hỗ trợ tôi rất nhiều về các thủ tục hành chính trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo trƣờng Đại học Quy Nhơn, Khoa Khoa học Tự nhiên, Bộ môn Sinh học ứng dụng và Nông nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi đƣợc đi học và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc và học tập. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã nhiệt tình động viên và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận án này. Hà Nội, ngày 28 tháng 8 năm 2023 Nghiên cứu sinh Trần Lan Đài MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.
4 DANH MỤC BẢNG. 6 DANH MỤC HÌNH. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. BỆNH BẠC LÁ LÚA VÀ VI KHUẨN XOO.
Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Các gen/QTL liên quan đến tính kháng bệnh bạc lá lúa. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá dựa vào gen kháng. VAI TRÒ CỦA HỌ GEN SWEET VÀ TALE TRONG MỐI TƢƠNG TÁC GIỮA THỰC VẬT VÀ MẦM BỆNH.
Họ gen SWEET ở thực vật. Vai trò của gen SWEET trong mối tƣơng tác giữa thực vật và mầm bệnh. Tƣơng tác đặc hiệu giữa TALE và SWEET. Các gen nhiễm OsSWEET và TALE liên quan đến bệnh bạc lá lúa.
HỆ THỐNG CHỈNH SỬA GEN CRISPR/Cas9 VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG. Giới thiệu về công nghệ chỉnh sửa gen. Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9. Chỉnh sửa gen thực vật bằng hệ thống CRISPR/Cas9.
Ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trong chỉnh sửa gen thực vật. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Mẫu thực vật. Chủng vi sinh vật.
Vector và oligonucleotide. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA. Nhân dòng và giải trình tự đoạn DNA đích.
Gieo trồng lúa, nuôi cấy vi khuẩn và lây nhiễm bệnh nhân tạo. Phân lập và định danh vi khuẩn Xoo. Phân tích TALome của vi khuẩn Xoo. Thiết kế trình tự sgRNA.
Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện. Nuôi cấy in vitro và chuyển gen vào lúa TBR225. Phân tích các dòng lúa chuyển gen/chỉnh sửa gen. Xử lý số liệu thống kê.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA QUẦN THỂ XOO Ở PHÍA BẮC VIỆT NAM TRÊN GIỐNG LÚA TBR225. Phân lập Xoo từ một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Nghiên cứu tƣơng tác phân tử giữa VXO và giống lúa TBR225.
THIẾT KẾ CẤU TRÚC T-DNA CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET. Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 chỉnh sửa đa gen. Thiết kế vector mang cấu trúc biểu hiện sgRNA chỉnh sửa SW13-TBR và SW14-TBR. TẠO DÒNG LÚA TBR225 CHỈNH SỬA SW14-TBR.
Tối ƣu quy trình chuyển gen vào lúa TBR225 thông qua A. Chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-TBR vào giống lúa TBR225. Nghiên cứu kiểu gen của cây lúa TBR225 tái sinh đƣợc chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-TBR. Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen và kiểu hình của các dòng lúa TBR225 chuyển vector chỉnh sửa SW14-TBR T1.
Nghiên cứu ảnh hƣởng của đột biến SW14-TBR đến kiểu hình của dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen T2. TẠO DÒNG LÚA TBR225 CHỈNH SỬA SW13-TBR VÀ SW14-TBR. tumefaciens mang vector chỉnh sửa SW13-TBR và SW14-TBR. Chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW13-TBR và SW14-TBR vào giống lúa TBR225.
Nghiên cứu kiểu gen của cây lúa TBR225 tái sinh đƣợc chuyển cấu trúc T- DNA chỉnh sửa SW13-TBR và SW14-TBR. Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen và kiểu hình của các dòng lúa TBR225 chỉnh sửa SW13-TBR và SW14-TBR T1. 141 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 143 TÀI LIỆU THAM KHẢO.
144 PHỤ LỤC 3 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt BAP : 6-benzyl amino purine Tên một loại chất điều hòa sinh trƣởng thực vật Cas : CRISPR associated protein Protein liên kết CRISPR CRISPR : Clustered regularly interspaced Nhóm trình tự lặp ngắn, đối short palindromic repeats xứng, cách đều nhau crRNA : CRISPR RNA ARN nhóm trình tự lặp ngắn, đối xứng, cách đều nhau DSB : Double strand break Đứt gãy sợi đôi EBE : Effector binding element Yếu tố cis liên kết effector GE : Genome editing Chỉnh sửa gen Gen R : Resistance gene Gen kháng Gen S : Susceptibility gene Gen nhiễm/gen mẫn cảm HDR : Homology-directed Tái tổ hợp tƣơng đồng recombination HPT : Hygromycin phosphotransferase Tên một loại enzyme xúc tác NIL : Near isogenic line Dòng cận đẳng gen NHEJ : Non-homologous end joining Ghép nối tận cùng không tƣơng đồng PAM : Protospacer adjacent motif Trình tự gần protospacer PCR : Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp QTL : Quantitative trait locus Locus tính tạng số lƣợng RT-qPCR : Quantitive reverse transcription Phiên mã ngƣợc và phản ứng polymerase chain reaction chuỗi trùng hợp định lƣợng RVD : Repeat variable diresidue Vị trí gốc axit min siêu biến đổi và lặp lại sgRNA : Single guide RNA RNA dẫn đƣờng đơn phân tử SW13-TBR : Promoter region of OsSWEET13 Promoter OsSWEET13 của in rice cultivar TBR225 giống lúa TBR225 4 SW14-TBR : Promoter region of OsSWEET13 Promoter OsSWEET14 của in rice cultivar TBR225 giống lúa TBR225 SWEET : Sugar will eventually be exported Protein vận chuyển đƣờng transporter T3SS : Type III secretion system Hệ thống tiết loại III TALE : Transcription activator-like Effector tƣơng tự yếu tố hoạt effector hóa phiên mã TALEN : Transcription activator-like Effector tƣơng tự yếu tố hoạt effector nuclease hóa phiên mã có hoạt tính nuclease tracrRNA : Trans-activating CRISPR RNA RNA hoạt hóa CRISPR VXO : Vietnamese Xanthomonas oryzae Vi khuẩn gây bệnh bạc lá đƣợc pv. oryzae thu thập ở Việt Nam Xoo : Xanthomonas oryzae pv. oryzae Vi khuẩn gây bệnh bạc lá ZFN : Zinc finger nuclease Nuclease ngón tay kẽm 5 DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Mẫu lúa nhiễm bệnh bạc lá (2016-2018) sử dụng trong nghiên cứu.
Các chủng vi khuẩn Xoo sử dụng trong nghiên cứu. Thang điểm đánh giá tính kháng/nhiễm bệnh bạc lá. Danh sách isolate Xoo phân lập đƣợc ở phía Bắc Việt Nam. Trình tự crRNA chỉnh sửa SW13-TBR và SW14-TBR.
Các trình tự DNA tƣơng đồng với crRNA trong hệ gen lúa. Ảnh hƣởng của chất ĐHST tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo. Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen vào mô sẹo. Kết quả biến nạp cấu trúc pCas9/sgRNA-SW14 vào lúa TBR225.
Kiểu gen SW14-TBR của các dòng lúa TBR225 chuyển gen T0. Phân ly di truyền của dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen T1. Đánh giá kiểu hình của dòng lúa TBR225 chỉnh sửa SW14-TBR T1. Đánh giá chỉ tiêu nông học của dòng lúa đột biến SW14-TBR T2.
Kết quả biến nạp cấu trúc pCas9/SW13-SW14 vào lúa TBR225. Kết quả sàng lọc cây lúa TBR225 chuyển gen bằng PCR. Giải trình tự SW13-TBR và SW14-TBR của cây lúa chuyển gen T0. Sàng lọc các dòng lúa chỉnh sửa SW13-TBR và SW14-TBR T1.
Giải trình tự SW13-TBR và SW14-TBR dòng lúa chỉnh sửa gen T1. Đánh giá tính kháng dòng lúa chỉnh sửa SW13-TBR và SW14-TBR. Đánh giá kiểu hình dòng lúa chỉnh sửa SW13-TBR và SW14-TBR T1. 137 6 DANH MỤC HÌNH Hình 1.
Bản đồ phân bố bệnh bạc lá lúa trên thế giới. Triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa. Hình thái vi khuẩn Xoo. Vi khuẩn Xoo xâm nhập vào bên trong lá lúa.
Vai trò của protein SWEET cung cấp chất dinh dƣỡng cho mầm bệnh. Tạo cây trồng kháng bệnh thông qua chỉnh sửa gen SWEET. Tƣơng tác đặc hiệu giữa TALE và EBE trên promoter của gen đích. Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9.
Cơ chế hoạt động của hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9. Các bƣớc cơ bản trong chỉnh sửa gen thực vật bằng CRISPR/Cas9. Lây nhiễm nhân tạo Xoo trên lúa bằng phƣơng pháp cắt lá. Lây nhiễm nhân tạo Xoo trên lúa bằng phƣơng pháp tiêm lá.
Sơ đồ thiết kế vector pEN-V2. Sơ đồ thiết kế vector pEN-V1/sgRNA-SW13. Sơ đồ thiết kế vector pEN-V2/sgRNA-SW14. Sơ đồ thiết kế vector pEN/SW13-SW14.
Sơ đồ thiết kế vector pCas9/SW13-SW14. Vi khuẩn Xoo đƣợc phân lập từ mẫu lúa bệnh. Định danh vi khuẩn phân lập bằng PCR đa mồi. Độc tính của các isolate Xoo trên giống lúa TBR225.
Phân tích trình tự TALE AvrXa7 của isolate VXO. Phân tích trình tự TALE PthXo2 của isolate VXO. Biểu hiện của OsSWEET trong cây lúa TBR225 nhiễm Xoo. Phân lập SW13-TBR từ DNA tổng số.
So sánh trình tự nucleotide của promoter OsSWEET13 .
Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ
Câu hỏi thường gặp
Luận án "Tăng cường kháng bệnh bạc lá lúa TBR225 bằng CRISPR/Cas9" nghiên cứu về vấn đề gì?
Tăng cường kháng bệnh bạc lá cho giống lúa tbr225 qua công nghệ CRISPR-Cas9. Mục tiêu là nâng cao khả năng chống chịu, cải thiện năng suất cây trồng.
Luận án "Tăng cường kháng bệnh bạc lá lúa TBR225 bằng CRISPR/Cas9" được bảo vệ tại trường nào?
Luận án này được bảo vệ tại Đại học Quốc gia Hà Nội. Năm bảo vệ: 2023.
Luận án "Tăng cường kháng bệnh bạc lá lúa TBR225 bằng CRISPR/Cas9" thuộc chuyên ngành gì?
Luận án "Tăng cường kháng bệnh bạc lá lúa TBR225 bằng CRISPR/Cas9" thuộc chuyên ngành Công nghệ sinh học. Danh mục: Công Nghệ Sinh Học.
Luận án "Tăng cường kháng bệnh bạc lá lúa TBR225 bằng CRISPR/Cas9" có bao nhiêu trang?
Luận án "Tăng cường kháng bệnh bạc lá lúa TBR225 bằng CRISPR/Cas9" có 172 trang. Bạn có thể xem trước một phần tài liệu ngay trên trang web trước khi tải về.
Cách tải luận án "Tăng cường kháng bệnh bạc lá lúa TBR225 bằng CRISPR/Cas9" về máy như thế nào?
Để tải luận án về máy, bạn nhấn nút "Tải xuống ngay" trên trang này, sau đó hoàn tất thanh toán phí lưu trữ. File sẽ được tải xuống ngay sau khi thanh toán thành công. Hỗ trợ qua Zalo: 0559 297 239.