Luận án tiến sĩ về biệt hóa tế bào gốc thành tế bào gan - Nghiên cứu 2024

i Bà GIÁO DĀC VIàN HÀN LÂM KHOA HàC VÀ ĐÀO T¾O VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM HâC VIàN KHOA HâC VÀ CÔNG NGHà ----------------------------- Đæ TRUNG KIÊN NGHIÊN CĄU BIàT HÓA T¾O T¾ BÀO CÓ CHĄC NNG GAN TĆ T¾ BÀO GàC TRUNG MÔ CUàNG RàN LUÀN ÁN TI¾N SĨ CÔNG NGHà SINH HâC Hà Nội - Năm 2024 iii MĀC LĀC Trang LàI CAM ĐOAN .ii LàI CÀM ¡N. iii DANH MĀC CÁC KÝ HIàU, CÁC CHĀ VI¾T TÂT. vi DANH MĀC CÁC BÀNG .vii DANH MĀC CÁC HÌNH VẼ, Đâ THà. TäNG QUAN NGHIÊN CĄU.

Nguãn t¿ bào gác trung mô, tiÁm nng biát hóa và ąng dāng. Nguồn tế bào gác trung mô. Tiềm năng biát hóa cÿa tế bào gác trung mô. Āng dāng cÿa tế bào gác trung mô.

CÃu t¿o cuáng rán, °u điểm căa t¿ bào gác trung mô tć cuáng rán. Cấu t¿o cuáng rán. ¯u điểm cÿa tế bào gác trung mô từ cuáng rán. Tình hình nghiên cąu.

Tình hình nghiên cāu tế bào gác ng°ßi. Tình hình nghiên cāu biát hóa t¿o tế bào gan. VÀT LIàU VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU. VÁt liáu, hóa chÃt nghiên cąu.

Hóa chất và các bá kit sử dāng. Môi tr°ßng thao tác, nuôi cấy, bÁo quÁn. Ph°¢ng pháp nghiên cąu. Thu nhận, phân lập và nhân nuôi tế bào.

Ph°¡ng pháp cấy chuyển tế bào. Ph°¡ng pháp đông l¿nh và giÁi đông tế bào. Ph°¡ng pháp nhuám nhißm sắc thể. Ph°¡ng pháp đánh giá tiềm năng biát hóa cÿa tế bào phân lập đ°ÿc.

Ph°¡ng pháp đánh giá đặc tr°ng tế bào gác cÿa tế bào phân lập đ°ÿc. Ph°¡ng pháp đánh giá tác đá tăng tr°áng tế bào. Ph°¡ng pháp biát hóa t¿o tế bào có chāc năng gan. Ph°¡ng pháp đánh giá các chỉ thß cÿa tế bào sau xử lý biát hóa.

Ph°¡ng pháp xử lý sá liáu. K¾T QUÀ VÀ THÀO LUÀN. Thu nhÁn, phân lÁp, nhân nuôi in vitro TBGTM tć m¿u cuáng rán. Thu nhận, phân lập tế bào gác từ mÁnh mô cuáng rán.

Nhân nuôi in vitro, bÁo quÁn l¿nh tế bào gác cuáng rán. Đánh giá tác đá tăng tr°áng cÿa tế bào. Đánh giá tính ån đánh, tiÁm nng biát hóa và khÁ nng duy trì nguãn TBGTM trong điÁu kián nuôi in vitro. Đánh giá tính ổn đßnh di truyền cÿa TBG phân lập đ°ÿc.

Đánh giá tiềm năng biát hóa cÿa tế bào gác. Đánh giá đặc tr°ng tế bào gác trung mô. Biát hóa TBGTM cuáng rán thành t¿ bào có biểu hián các chß thá đặc tr°ng t¿ bào gan. Biát hóa bằng DMSO.

Biát hóa bằng tổ hÿp cÿa HGF, DEX và OSM. Biát hóa bằng tổ hÿp HGF, TSA và OSM. Biát hóa bằng chuyển gen HNF4α. 73 K¾T LUÀN VÀ KI¾N NGHà.

92 DANH MĀC CÔNG TRÌNH CÔNG Bà LIÊN QUAN Đ¾N LUÀN ÁN. 94 DANH MĀC TÀI LIàU THAM KHÀO. PHI¾U TÌNH NGUYàN THAM GIA NGHIÊN CĄU. BÀN CUNG CÂP THÔNG TIN NGHIÊN CĄU.

DANH SÁCH CÁ NHÂN TÌNH NGUYàN THAM GIA NGHIÊN CĄU&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&116 PHĀ LĀC 4. THI¾T Bà NGHIÊN CĄU. MÔI TR¯àNG DÙNG TRONG NGHIÊN CĄU. TRÌNH TĂ CDS CĂA GEN HNF4α.

124 vi DANH MĀC CÁC KÝ HIàU, CÁC CHĀ VI¾T TÂT Tć Ti¿ng Anh Ti¿ng Viát vi¿t tÃt AFP Alpha-fetoprotein ALB Albumin BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò DEX Dexamethasone DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl sulfoxide Dox Doxycycline ECM Extra Cellular Matrix Chất nền ngo¿i bào Yếu tá tăng tr°áng tế bào biểu EGF Epidermal Growth Factor bì FBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh thai bò Yếu tá tăng tr°áng nguyên bào FGF Fibroblast Growth Factor sÿi GF Grow Factor Yếu tá tăng tr°áng HGF Hepatocyte Growth Factor Yếu tá tăng tr°áng tế bào gan HNF Hepatocyte Nuclear Factors Những yếu tá nhân tế bào gan HNF-4 Hepatocyte nuclear factor 4 HNF-4α Hepatocyte nuclear factor 4 alpha OSM Oncostatin M PAS Periodic Acid-Schiff Bá kit Periodic Acid-Schiff PBS Phosphate Buffered Saline TBG Tế bào gác TBGTM Tế bào gác trung mô TGF Transforming Growth Factor Yếu tá tăng tr°áng chuyển d¿ng TSA Trichostatin A Lớp mô đám th¿ch Wharton cÿa WJ Wharton’s Jelly dây rán vii DANH MĀC CÁC BÀNG BÁng 2. Thành phần phÁn āng RT-PCR&&&&&&&&&&&&&& 34 BÁng 2. Trình tự oligonucleotide các mồi đ°ÿc sử dāng để đánh giá đặc tr°ng TBG và chỉ thß chāc năng tế bào gan &&&&&&&&&. Các cặp mồi đ°ÿc thiết kế để chuẩn bß vector mang gen HNF4α.

Tỷ lá thành phần phÁn āng cắt cÿa HNF4α và pTRE-Tight-BI bằng 2 enzyme NheI và PacI. Tỷ lá thành phần phÁn āng cắt cÿa pTRE-Tight-BI-HNF4α và 38 pTet-DualON bằng 2 enzyme NsiI và PacI. Các đo¿n mồi đ°ÿc sử dāng trong qPCR&&&&&&&&&&. Kết quÁ đếm tế bào và tỷ lá sáng tế bào&&&&&&&&&&&.

Sự tăng sinh TBGTM cÿa mẫu mô cuáng rán t°¡i và mô cuáng rán đông l¿nh từ giai đo¿n cấy chuyển 2 đến giai đo¿n cấy chuyển 5. Biểu hián cÿa các chỉ thß TBGTM qua các lần cấy chuyển&&. Tỷ lá tế bào biểu hián các chỉ thß TBG tr°ớc và sau đông l¿nh&&. Kết quÁ đo mật đá quang (OD) cÿa các mẫu RNA tách chiết&.

Biểu hián các chỉ thß bề mặt trong quá trình nuôi in vitro…………… 61 BÁng 3. Biểu hián cÿa các chỉ thß phân tử á tế bào sau biát hóa bằng DMSO&&&. 64 viii DANH MĀC CÁC HÌNH VẼ, Đâ THà Hình 1. Tiềm năng biát hóa cÿa TBGTM &&&&&&&&&&& 4 Hình 1.

Triển váng āng dāng cÿa công nghá tế bào gác&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. Āng dāng cÿa TBGTM đ°ÿc thử nghiám trên lâm sàng (phân lo¿i theo ca bánh)&&&&&&&&&&&&&&&&& 8 Hình 1. Āng dāng cÿa TBGTM đ°ÿc thử nghiám trên lâm sàng (phân lo¿i theo pha)&&&&&&&&&&&&&&&. Sá l°ÿng và tỷ lá các thử nghiám lâm sàng về điều trß TBGTM cho bánh gan&&&&&&&&&&&&&&.

Mặt cát ngang cấu trúc cÿa dây rán&&&&&&&&&&. Mô hình sử dāng tế bào gan biát hóa từ tế bào gác&&&. Các phân tử nhß t¿o tế bào có chāc năng gan hoặc thúc đẩy sự tr°áng thành cÿa tế bào giáng với tế bào gan&. Cấu trúc vector pTRE-HNF4α-ON.

Phân lập tế bào gác cuáng rán từ mÁnh mô&&&&&&&. Tế bào mác sau khi phân lập bằng ph°¡ng pháp nuôi mÁnh mô. Quá trình phát triển in vitro cÿa tế bào phân lập đ°ÿc. Ành h°áng cÿa nhiát đá bÁo quÁn TBGTM đến khÁ năng tăng tr°áng cÿa tế bào sau giÁi đông&&&&&&&&&&&.

Tế bào tr°ớc khi đông l¿nh (P4) (trái) và sau khi giÁi đông (P6) (phÁi)&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. Các tế bào phát triển từ mô cuáng rán t°¡i (A) và mô cuáng rán đông l¿nh (C), TBGTM che kín bề mặt đĩa nuôi á giai đo¿n cấy chuyển lần 2 từ mô t°¡i (B) và mô đông l¿nh (D). Biểu đồ tác đá tăng tr°áng cÿa tế bào P4 tr°ớc đông l¿nh và tế bào P4 sau đông l¿nh. Tổng sá tế bào tăng sinh đ°ÿc ghi l¿i mßi ngày trong 7 ngày nuôi cấy á 2 nhóm thí nghiám: mô cuáng rán t°¡i và mô cuáng rán đông l¿nh&&&&&&&&&&&&&&&& 50 Hình 3.

Quan sát nhißm sắc thể trên kính hiển vi (A) và nhißm sắc thể đồ (B) cÿa tế bào nuôi á lần cấy chuyển thā 2&&&&&&. Quan sát nhißm sắc thể trên kính hiển vi và nhißm sắc thể đồ cÿa tế bào nuôi á lần cấy chuyển thā 10 (A), (B) và thā 15 (C),(D)&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. Kết quÁ biát hóa TBGTM thành tế bào mỡ&&&&&&& 53 Hình 3. Các tế bào giát mỡ bắt màu đß khi nhuám với thuác nhuám Oil red xuất hián sau biát hóa á nhóm mô cuáng rán t°¡i (A) và mô cuáng rán đông l¿nh (B)&&&&&&&&&.

Kết quÁ biát hóa TBGTM thành nguyên bào x°¡ng&&&. Các tế bào bắt màu đß khi nhuám với thuác nhuám Alizarin red á nhóm mô cuáng rán t°¡i (A) và mô cuáng rán đông l¿nh (B)&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. Biểu hián các chỉ thß bề mặt TBGTM cÿa mẫu tế bào phân lập từ mô cuáng rán á lần cấy chuyển 4 phân tích bằng flow cytometry&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 56 Hình 3. Tỷ lá tổ hÿp các chỉ thß đặc tr°ng không biểu hián trong TBGTM cÿa các mẫu á lần cấy chuyển 4 phân tích bằng flowcytometry&&&.

Biểu hián các chỉ thß bề mặt TBGTM cÿa mẫu cuáng rán t°¡i á lần cấy chuyển 2.18 Biểu hián các chỉ thß bề mặt TBGTM cÿa mẫu cuáng rán đông l¿nh á lần cấy chuyển 2 &&&&&&&&&&&& 57 Hình 3. Kết quÁ đián di với các chỉ thß á lần cấy chuyển 20&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. Kết quÁ đián di với các chỉ thß CD105, CD90, CD73 cÿa mẫu tế bào tr°ớc đông l¿nh, nuôi cấy sau 33 ngày và 21 ngày từ lúc phân lập (A), mẫu tế bào sau giÁi đông (B)&&&&&& 63 x Hình 3. Hình thái cÿa tế bào tr°ớc và khi xử lý bằng DMSO 1% sau 30 ngày và so sánh với tế bào HepG2&&&&&&&&& 64 Hình 3.

Biểu hián chỉ thß phân tử cÿa tế bào biát hóa bằng DMSO 1% sau 30 ngày và so sánh với tế bào HepG2&&&&&&&& 65 Hình 3. Kết quÁ nhuám PAS&&&&&&&&&&&&&&&& 67 Hình 3. Hình thái tế bào biát hóa bằng tổ hÿp HGF, DEX và OSM sau 1 tuần (A) và 2 tuần (B)&&&&&&&&&&&&&. Kết quÁ sÁn phẩm RT-PCR tế bào nuôi cấy 4 tuần sau biát hóa bằng tổ hÿp cÿa HGF, DEX và OSM&&&&&&&.

Kết quÁ nhuám PAS&&&&&&&&&&&&&&&& 69 Hình 3. Hình thái tế bào xử lý biát hóa bằng tổ hÿp HGF, TSA và OSM sau 1 tuần (A) và 2 tuần (B)&&&&&&&&&&& 70 Hình 3. Đián di đồ RT-PCR mẫu nuôi cấy 4 tuần sau biát hóa bằng tổ hÿp cÿa HGF, TSA và OSM&&&&&&&&&&&. Kết quÁ nhuám PAS&&&&&&&&&&&&&&&& 72 Hình 3.

Đián di đồ kiểm tra sÁn phẩm PCR khuếch đ¿i CDS gen HNF4α&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 73 Hình 3. Kết quÁ tinh s¿ch sÁn phẩm HNF4α và pTRE-Tight-BI cắt bằng enzyme NheI và PacI. Đĩa biến n¿p sÁn phẩm nái pTRE-Tight-BI-HNF4α vào E. Kết quÁ sÁn phẩm cắt pTRE-Tight-BI-HNF4α bằng NheI và PacI.

Kết quÁ cắt vector pTet-DualON bằng 2 enzyme NsiI và PacI&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. Kết quÁ tinh s¿ch sÁn phẩm cắt pTRE-Tight-BI-HNF4α và sÁn phẩm cắt pTet-DualON bằng 2 enzyme NsiI + PacI&&&&&&. Đĩa biến n¿p sÁn phẩm nái pTRE-HNF4α-ON vào E. Kết quÁ kiểm tra sÁn phẩm cắt plasmid pTRE-HNF4α-ON bằng enzyme&&&&&&&&&&&&&&&&&&.

Tác đá tăng tr°áng cÿa TBGTM sau khi đ°ÿc chuyển nhißm. Biểu đồ sinh tr°áng cÿa tế bào sau chuyển gen ho¿t hóa bằng Doxycycline&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 81 Hình 3. Sự phát huỳnh quang xuất hián trong tế bào chất cÿa tế bào 2 ngày sau chuyển gen và ho¿t hóa bằng Doxycycline &&&. Trong quá trình chuyển gen hình thái tế bào có sự biến đổi&.

Biểu hián cÿa các chỉ thß tr°ớc và sau khi chuyển gen&&. Hình Ánh tế bào nhuám mißn dßch huỳnh quang sau 2 tuần biát hóa&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. Kết quÁ qPCR xác đßnh māc đá biểu hián mRNA cÿa các gen HNF4α (A), CYP3A4 (B), ALB (C) và AFP (D) t¿i các thßi điểm khác nhau&&&&&&&&&&&&&&&&&& 87 Hình 3. Kết quÁ nhuám PAS cÿa nhóm tế bào chuyển gen HNF4α sau 2 tuần.

90 1 Mâ ĐÄU Lý do chãn đÁ tài: Tế bào gác (TBG) là những tế bào có khÁ năng tự t¿o mới và có tiềm năng biát hoá thành nhiều lo¿i tế bào khác nhau. Khác với các tế bào khác, TBG ch°a có chāc năng chuyên môn hóa cā thể.