Luận án Tiến sĩ: Lúa chuyển gen NAC chịu hạn - Phạm Thu Hằng (ĐHQGHN)

ĐẠI HỌC QUÓC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thu Hằng LUẬN ÁN TIÉN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUÓC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thu Hằng Chuyên ngành: Hóa sinh hoc Mã số: 62420116 LUẬN ÁN TIÉN SĨ SINH HỌC HƯỚNG DAN KHOA HỌC: PGS. Phạm Xuân Hội Hà Nội - 2018 LOICAM DOAN Tôi xin cam đoan: Luan án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Phạm Xuân Hội. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được tác giả nào công bố trong bat kỳ công trình nào khác.

Tôi xin chịu trách nhiệm vê nghiên cứu của mình. Hà Noi, ngày 26 tháng 8 năm 2018 Nghiên cứu sinh Phạm Thu Hằng LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Phạm Xuân Hội (Viện Di truyền Nông nghiệp) là người thay đã tận tình hướng dan, giúp đỡ và tạo mọi diéu kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Phong Sau Đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh hoc (Trường ĐH KHTN) và Ban lãnh đạo Viện Di truyén Nong nghiép da tao moi diéu kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi hoàn tat các thủ tục cân thiết trong quá trình học tập và thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thây, cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật - Hóa sinh (Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN) đã giảng day trong suốt khóa học và tập thể cắn bộ nghiên cứu của Bộ môn Bệnh hoc Phân tu (Viện DTNN) và các ban bè, dong nghiệp đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho tôi để hoàn thành luận án tốt nghiệp này. Tôi xin được cảm ơn gia đình và người than đã luôn ở bên cạnh tôi, quan tâm, cảm thông và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án. Hà Nội ngày 26 tháng 8 năm 2018 Phạm Thu Hằng DANH MỤC CHỮ VIET TẮTT.-- ¿2 2 +E+E£+E+EE£E£EE2E£EE2EEEEEEEEEEEEEEEEErErrerkeree 1 M. 6 DANH MỤC HÌNH.

cxe 7 MỞ DAU. 9 Chương 1: TONG QUAN. GIỚI THIỆU CHUNG VE CAY L/ÚA.Đặc điểm sinh học của cây lúa OL yZd S@fiVđ.Anh hưởng của hạn hán đối với ngành sản xuất lúa gạo.Ảnh hưởng của hạn tới cây lúa. VAI TRO CUA NHÂN TO PHIÊN MÃ LIEN QUAN TỚI ĐÁP UNG STRESS HAN Ở THUC VẬTT.Vai trò của nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng stress hạn ở thực 1.Nhân tố phiên mã NAC và vai trò đáp ứng stress hạn ở thực vật.

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VÀ CƠ CHE CHUYEN GEN VÀO THUC VAT 0 ~-.Giới thiệu chung về vi khuẩn A. Cơ chế phân tử của việc chuyên gen thông qua A.Hệ thống vector/promoter dùng trong chuyên gen thực vật. TINH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIÓNG LUA CHUYEN GEN CHONG 1.Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chống chịu hạn trên 1¬.Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen ở Việt Nam. 47 Chương 2: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.Đối tượng nghiên cứu .Chủng vi sinh VẬ(.c- Quy nh nh nh kề 50 2.Vector va oligonucleotide .---- cv cv vế 50 2.- ác 11 112111 1101111111111 111 01 0110111 HH Hà nàng 51 2.

102011211121 1121 1221111110111 101111 nà HH nhà Ha 52 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU .Xử lý mẫu thực vVật.Tách chiết, định lượng DNA/RNA. Nhân dòng gen OsNACI, OsNAC5 và OsNACT0 vào vector pGEM-T .Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen OsNACI trong tế bào thực vật.Tạo cây lúa chuyền gen biểu hiện ØsWAC1.Sang lọc các dòng lúa chuyển gen.Các phương pháp định lượng sinh lý, sinh hóa ở cây lúa.Phương pháp xử lý số liệu thống kê.- ¿+ 5-5222 2 22 2x2 65 Chương 3: KET QUA NGHIÊN CỨU & THẢO LUẬN .PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TÓ PHIÊN MÃ NHÓM NAC LIÊN QUAN DEN TÍNH CHIU HAN © LUA .Khảo sát khả năng chịu hạn của một số giống lúa Việt Nam.Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn.-----ccc 1112001000211 11211 esses een vn nhu nhu kh nhu cu 67 3.Phân tích biểu hiện của OsNACI, OsNAC5 va OsNACT0 trong điều 3. THIET KE VECTOR BIEU HIỆN OsNACI TRONG TE BAO THUC VAT78 3.

Thiết kế vector biểu hiện OsNACI điều khiển bởi promoter hoạt động LEM tỤC.-- -cc HH SH TH TH TK TH nh ch ch, 78 3.Thiết kế vector biểu hiện OsNACI điều khiển bởi promoter hoạt động [Ò”110809551E-150+). NGHIÊN CỨU CHUYEN GEN OsNACT VÀO CÂY LÚA.Biến nạp vector biểu hiện vào A.Nghiên cứu chuyền gen OSNACI vào lúa.Sàng lọc các dòng lúa tái sinh được chuyển cấu trúc biểu hiện 0/2205.Chon loc dòng lúa chuyền gen TTị.Chọn lọc dòng lúa chuyển gen T;. ĐÁNH GIÁ SINH TRUONG PHÁT TRIEN VÀ KHẢ NANG CHIU HAN CUA CÁC DONG LUA CHUYEN GEN .Đánh giá sinh trưởng, phát triển của các dòng lúa chuyên gen T;.Đánh giá khả năng chịu hạn của các dong lúa chuyền gen.-- ¿5-5222 2192121 2E21212112121121211212111111111111111111111 21111111 re 117 KIÊN NGHỊ,.- - 2 5z SS9SE2EEEE2EEEE232121121211212111111111111111111111 111111 xe 118 DANH MỤC CÔNG TRINH KHOA HOC CUA TÁC GIA LIEN QUAN DEN LUẬN AN.oecessscsssscsssssesessssssssesscssssssccsssussssusssssssesussssusssssssessssssssssesussesussesseseeess 119 TAI LIEU THAM KHAO0.ceccsccscsscssssessssessssesssssssscssssssessssessssessssesesestseessiess 120 PHU LUC .oceeccecccssccsssesscscscsscscsucscsscssssssvssssvsscsecsssusassucsssucscsussesassessssesissesassessssecsees 1 DANH MỤC CHU VIET TAT 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid ABA : Abscisic acid ABRE : Yếu tố dap ứng acid abscisic chứa trình tự ACGT (ACGT-containing abscisic acid response element) AD : Vung tác động (acting domain) AMP : Adenosine monophosphate ATP : Adenosine triphosphate BAP : 6-Benzylaminopurine BD : Vùng liên kết (binding domain) BDKH : Biến đổi khí hậu bp : Cặp bazo (base pair) cDNA : DNA bồ sung (complementary deoxyribonucleic acid) Œ, : Chu kỳ ngưỡng (threshold cycle) DEPC : Diethylpyrocarbonate DMSO : Dimethyl sulfoxide dNTP : Deoxyribonucleoside Triphosphate DRE : Yéu tố đáp ứng han (dehydration responsive element) DREB : Protein liên kết với yếu tổ đáp ứng han DRE (dehydration responsive element-binding protein) EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr : Ethidium bromide IPTG : Isopropyl B-D-1-thiogalactopyranoside kb : Kilobase LB : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Luria-Bertani LEA : Protein hình thành trong giai đoạn phát triển muộn của phôi (late embryogenesis abundant) MCS : Vùng nhân dòng đa điểm cat (multiple cloning site) MOPS : Acid 3-(N-morpholino)propansulfonic 4 mRNA : Messenger ribonucleic acid MS : Môi trường nuôi cay thực vat Murashige & Skoog NAA : 1-naphthaleneacetic acid NAC : NAM/ATAF1/2/CUC2 NACRS : Trinh tự nhận biết protein NAC (NAC recognition sequence) NST : Nhiễm sắc thé OD : Mật độ quang học (optical density) ORF : Khung đọc mở (open reading frame) PCR : Phan ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction) PEG : Polyethylene glycol RT-PCR : Phản ứng nhân bản DNA sao chép ngược (reverse transcription polymerase chain reaction) ROS : Các chất oxy hoạt hóa (reactive oxygen species) RWC : Hàm lượng nước tương đối (relative water content) qRT-PCR : Phản ứng chuỗi trùng hợp định lượng thời gian thực (Real-time quantiative polymerase chain reaction) SDS : Sodium dodecyl sulfate TAE : Dém Tris-acetate-EDTA TE : Dém Tris-EDTA TF : Nhân tố phiên mã (transcription factor) Ti-plasmid : Plasmid gây khối u (tumor inducing plasmid) X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-galactopyranoside DANH MỤC BẢNG Bang 1.1: Chức năng của nhân tố phiên mã NAC.1: Trình tự cácoligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu.2: Thang điểm đánh giá khả năng chịu han của cây lúa theo IRRI.1: Kết qua đánh gid khả năng chịu hạn một số giống lúa Việt Nam .2: Kết quả chuyên gen vào lúa thông qua vi khuẩn A.3: Kết quả sàng lọc cây lúa tái sinh được chuyên gen OsWACT .4: Kết qua xác định số lượng ban sao gen kháng Hygromycin trong cây lúa chuyển gen T ọ.- ¿- ¿5 + St2St2E2E9EEEEEEEE22121121212121121121111111121121111121 111.5: Kết quả sinh trưởng của cây lúa chuyền gen Ty trong nhà lưới.6: Kết quả sang lọc các dong lúa chuyền gen TTỊ,.7: Kết qua sinh trưởng của các cây lúa chuyên gen đời T¡.8: Kết quả đánh giá khả năng chịu han của các dòng lúa chuyên gen dựa tren dO v08 1017.9: Kết quả xác định hàm lượng nước tương đối trong dòng lúa chuyên gen.10: Hàm lượng chat diệp lục a trong các dòng lúa chuyền gen.11: Hàm lượng chat diệp lục b trong các dòng lúa chuyền gen .12: Hàm lượng chat diệp lục tổng số trong các dòng lúa chuyền gen.13: Hàm lượng proline trong các dòng lÚa.14: Kết quả so sánh tương quan kha năng chịu hạn của các dong lúa. 115 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Mạng lưới các nhân tố phiên mã tham gia đáp ứng stress hạn.2: Sơ đồ câu trúc protein NAC.3: Mạng lưới điều hòa phiên mã các gen đáp ứng stress phi sinh học của nhân tố phiên mã NAC ở lúa .--2- + ¿55 2++S++S£2EE2E2E£EEEEEEEESEEEEerxerxerrerrrree 39 Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pCAM-Rd29A/OsNACI và pCAM- Lip9/OsNAC l.

HH HH HH TH 60 Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pBI-35S/OsNAC và pBI-Ubi/OsNACI .1: Tach chiết RNA tổng số từ mẫu lúa xử lý hạn.2: Nhân bản gen OsNACI, OsNACS và OsNAC10 bằng kỹ thuật PCR.3: Sang lọc thể biến nap bang PCR trực tiếp khuẩn lạc .4: Kiểm tra plasmid tái tổ hop bang PCR. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bang enzyme cắt giới hạn .6: Phân tích trình tự axit amin suy diễn của protein OsNACI, OsNACS và OsNAC10 của giống lúa Te Đỏ.7: Biéu hiện của OsNACI, OsNACS và OsNAC10 trong điều kiện hạn .8: Xử lý vector pBI-Ubi, pBI-35S và pGEM/OsNACI bang enzyme cắt giới I0 “-‹‹+1 79 Hình 3.9: PCR trực tiếp khuẩn lac mang pBI-Ubi/OsNAC1 và pBI-35S/OsNACI 80 Hình 3.10: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pBI-Ubi/OsNACI và pBI-35S/OsNACI .11: Xử lý vector pCAM-Rd29A và pCAM-Lip9 bang enzyme cắt giới han BaMy 02255755 .12: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pCAM-Rd29A/OsNACI và pCAM- 007/9).13: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCAM-Rd29A/OsNACI và pCAM-Lip9 /OsNACI bằng PCR và cắt giới hạn.14: PCR trực tiếp khuẩn lac mang pCAM-Rd/OsNACI, pBI-35S/OsNACI, 7 pBI-Ub1/OsNACT1 và pCAM-Lip9/OsNACT.-c ch ng re 86 Hình 3.15: PCR trực tiếp khuan lạc mang pBI101 và pCAMBIA1301.16: Chuyén cấu trúc biéu hiện gen OSNACI vào lúa.17: Biểu hiện của OsNACI trong các dòng lúa chuyên gen Ubi:OsNACI.18: Biéu hiện của OsNACI trong các dòng lúa chuyén gen Lip9:OsNACI .19: Đánh giá kha năng sinh trưởng của các dòng lúa chuyền gen.20: Các dòng lúa sau 2 tuần xử lý hạn.----- 2 + 2+s+cz+xez+zxezxzxees 103 Hình 3.21: Ảnh hưởng của hạn đến sự tích tụ HO) trong lá lúa .22: Khả năng phục hồi của các dòng lúa chuyên gen và dòng đối chứng sau MO DAU 1. Dat van dé Dưới tác động của biến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy ra thường xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, là nguyên nhân chính làm giảm sản lượng cây trồng. Trong khi đó, dân số toàn cầu tăng nhanh, ước tính năm 2050 sẽ tăng lên 9 tỷ người, ảnh hưởng nghiêm trọng đến an ninh lương thực, tạo ra một áp lực lớn cho việc đảm bảo lương thực.

Vi vậy, an ninh lương thực là van dé then chốt của nền khoa học nông nghiệp thé giới nói chung và Việt Nam nói riêng.) là một trong ba loại cây lương thực quan trọng nhất của con người.