Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm

ĐẠI HỌC QUÓC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thu Hằng NGHIEN CUU TAO DONG LUA CHUYEN GEN MA HOA NHAN TO PHIEN MA NHOM NAC LIEN QUAN DEN TINH CHIU HAN LUAN AN TIEN SI SINH HOC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUÓC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thu Hằng NGHIÊN CỨU TẠO DONG LUA CHUYEN GEN MA HOA NHAN TO PHIEN MA NHOM NAC LIEN QUAN DEN TINH CHIU HAN Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62420116 LUẬN AN TIEN SĨ SINH HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HOC: PGS. Phạm Xuân Hội Hà Nội - 2018 LOICAM DOAN T6i xin cam doan: Luan 4n 1a céng trinh nghién ctu thuc su cua cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Phạm Xuân Hội. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được tác giả nào công bố trong bắt kỳ công trình nào khác.

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Hà Nội, ngày 26 tháng Š năm 2018 Nghiên cứu sinh Phạm Thu Hằng LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Phạm Xuân Hội (Viện Di truyền Nông nghiệp) là người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điêu kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Phòng Sau Đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học (Trường ĐH KHTN) va Ban lãnh đạo Viện Di truyén Nong nghiép da tao moi diéu kién thudn loi va giúp đỡ tôi hoàn tắt các thủ tục cân thiết trong quá trình học tập và thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thây, cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật - Hóa sinh (Khoa Sinh học, Trường ĐH KHẨTN) đã giảng dạy trong suốt khóa học và tập thể cán bộ nghiên cứu của Bộ môn Bệnh học Phân tử (Viện DTNN) và các bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho tôi để hoàn thành luận án tốt nghiệp này. Tôi xin được cảm ơn gia đình và người thân đã luôn ở bên cạnh tôi, quan tâm, cảm thông và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án. Hà Nội ngày 26 tháng Š năm 2018 Phạm Thu Hằng DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮTT.-- ¿2 £+E+E£+E+EE+E£EE+EEEE2EEEEEEEEEEEEEEEErkrrerrrree 1 DANH MUC BANG. 6 DANH MUC HINH .ccccscscsssscsccsescscscscscsucscscsucscscssucscsesucsescsesscsesvsnesssesesecseeeeseees 7 MO DAU oieeececcccecscscscscsscscscsssscscsvsssecsvevsucsvsvsucscsvsvsscsesvsucacsvsvsacsvsvsusavsvssecavsvseseeeees 9 Chương 1: TÔNG QUAN.

GIỚI THIỆU CHUNG VÈẺ CÂY L/ÚA.Đặc điểm sinh học của cây lúa Ôryzd SafiVđ.Anh hưởng của hạn hán đối với ngành sản xuất lúa gạo.Ảnh hưởng của hạn tới cây lúa. VAI TRO CUA NHAN TO PHIEN MA LIEN QUAN TOI DAP UNG STRESS HAN Ở THỰỰC VẬTT.Vai trò của nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng stress hạn ở thực 1.Nhân tố phiên mã NAC và vai trò đáp ứng stress hạn ở thực vật. AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VA CO CHE CHUYEN GEN VÀO 0;09A2v 7 ~-.Giới thiệu chung về vi khuẩn A. Cơ chế phân tử của việc chuyên gen thông qua A.Hệ thống vector/promoter dùng trong chuyên gen thực vật.

TINH HINH NGHIEN CUU TAO GIONG LUA CHUYEN GEN CHONG 1.Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chống chịu hạn trên ¡1.Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen ở Việt Nam. 47 Chuong 2: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.Đối tượng nghiên cứu .Chủng vi sinh VẬ(.-c- HS ST Ty nh nh nh kề 50 2.Vector và oligonucÏeOfIde€ .----- cv cv srg 50 2. ác 2c 1 112111 1101111111111 1111 H1 1110111 TH HH nàng 51 2. - 2c 020112111211 1011121 1211111100111 11 Hà ng nhà Ha 52 2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU .Xử lý mẫu thực vVật.Tách chiết, định lượng DNA/RNA. Nhan dong gen OsNACI, OsNAC5 va OsNAC1O vao vector pGEM-T .Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen OsNACI trong té bao thuc vat.Tạo cây lúa chuyền gen biểu hiện OsWAC1.Sàng lọc các dòng lúa chuyển gen.Các phương pháp định lượng sinh lý, sinh hóa ở cây lúa.Phương pháp xử lý số liệu thống kê.- ¿+5 222cc * 2x2 65 Chương 3: KÉT QUẢ NGHIÊN CỨU & THẢO LUẬN .PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TÓ PHIÊN MÃ NHÓM NAC LIÊN QUAN ĐÉN TÍNH CHỊU HẠN Ở LLÚA .Khảo sát khả năng chịu hạn của một số giống lúa Việt Nam.Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn.---- c c S111 00 110101210111 11 101111 cv tk nhu kh nhu cu 67 3.Phân tích biểu hiện của OsNACI, OsNAC5 va OsNACIO trong diéu 3. THIET KE VECTOR BIEU HIEN OsNACI TRONG TE BAO THUC VAT78 3. Thiết kế vector biéu hién OsNACI điều khiển bởi promoter hoat động liÊn tỤC.-- cQ SH SH TT TT TH nh ch ch, 78 3.Thiết kế vector biểu hiện OsWMAC7 điều khiển bởi promoter hoạt động Cảm Ứng SfT€SS .- ch TH nh nh nhện 81 3.

NGHIÊN CỨU CHUYÊN GEN ØsWAC1 VÀO CÂY LÚA.Biến nạp vector biểu hiện vào A. ứ„mefäciens LBA4404.Nghién ctru chuyén gen ØsWAC7 vào lúa.Sàng lọc các dòng lúa tái sinh được chuyển cấu trúc biểu hiện SN CÌ. Q0 TH TH Tu TT Tu cu TT ki kh kh 91 3.Chọn lọc dòng lúa chuyền gen TTị. -- ¿+52 + 2+ ++z£+ex+zx+zxssx2 94 3.Chọn lọc dòng lúa chuyển gen T;.

DANH GIA SINH TRUONG PHAT TRIEN VA KHA NANG CHIU HAN CUA CAC DONG LUA CHUYEN GEN ovsssssssssssssssssssssssssssssssssssssssessesssssssssssssses 100 3.Đánh giá sinh trưởng, phát triển của các dòng lúa chuyên gen T;.Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyền gen.11 ke 117 KIÊN NGHỊ,. - - 52 St SE9SE2EEEE2EEEE2E21211212112121111111111111111112 11. xe 118 DANH MUC CONG TRINH KHOA HOC CUA TAC GIA LIEN QUAN DEN LUAN AN.iecessecsssscsssssssesssscssssssscssssssscsssucssucssssssesusassssassussessssussesussesucsesussesssaeess 119 TAI LIEU THAM KHAO.ccccsccscsssssssessssessssessssesssssssesussessescsissesissesssesssseestaess 120 PHU LUCooeeeeccecccssccscscsssscscsssscsscscsucscsussvesssvcsssvssssucscsucscsucscsussesissesussessssesissesasaeescees 1 DANH MỤC CHỮ VIẾT TAT 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid ABA : Abscisic acid ABRE : Yếu tố dap ứng acid abscisic chứa trình tự ACGT (ACGT-containing abscisic acid response element) AD : Vung tac déng (acting domain) AMP : Adenosine monophosphate ATP : Adenosine triphosphate BAP : 6-Benzylaminopurine BD : Vùng liên kết (binding domain) BDKH : Biến đổi khí hậu bp : Cap bazo (base pair) cDNA : DNA bé sung (complementary deoxyribonucleic acid) Œ, : Chu kỳ ngưỡng (threshold cycle) DEPC : Diethylpyrocarbonate DMSO : Dimethyl sulfoxide dNTP : Deoxyribonucleoside Triphosphate DRE : Yéu t6 dap tng han (dehydration responsive element) DREB :Protein liên kết với yếu tổ đáp ứng han DRE (dehydration responsive element-binding protein) EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr : Ethidium bromide IPTG : Isopropyl B-D-1-thiogalactopyranoside kb : Kilobase LB : Môi trường nuôi cấy vi khuan Luria-Bertani LEA : Protein hình thành trong giai đoạn phát triển muộn của phôi (late embryogenesIs abundant) MCS : Vùng nhân dòng đa điểm cắt (multiple cloning site) MOPS : Acid 3-(N-morpholino)propansulfonic 4 mRNA : Messenger ribonucleic acid MS : Môi trường nuôi cấy thyc vat Murashige & Skoog NAA : 1-naphthaleneacetic acid NAC : NAM/ATAF1/2/CUC2 NACRS : Trình tự nhận biết protein NAC (NAC recognition sequence) NST : Nhiễm sắc thể OD : Mật độ quang học (optical density) ORF : Khung doc mo (open reading frame) PCR : Phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction) PEG : Polyethylene glycol RT-PCR : Phản ứng nhân bản DNA sao chép ngược (reverse transcription polymerase chain reaction) ROS : Cac chat oxy hoat hda (reactive oxygen species) RWC : Hàm lượng nước tương đối (relative water content) qRT-PCR : Phản ứng chuỗi trùng hợp định lượng thời gian thực (Real-time quantiative polymerase chain reaction) SDS : Sodium dodecyl sulfate TAE : Dém Tris-acetate-EDTA TE : Dém Tris-EDTA TF : Nhân tố phiên mã (transcription factor) Ti-plasmid : Plasmid gây khối u (tumor inducing plasmid) X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-galactopyranoside DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Chức năng của nhân tố phiên mã NAC.- ¿2-5 + 2+s+E+£z£szxz£sez 40 Bang 2.1: Trình tự cácoligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu.2: Thang điểm đánh giá khả năng chịu hạn của cây lúa theo IRRI.1: Kết qua đánh giá khả năng chịu hạn một số giống lúa Việt Nam .2: Kết quả chuyên gen vào lúa thông qua vi khuẩn A.3: Kết quả sàng lọc cây lúa tái sinh được chuyên gen OsWACT .4: Kết quả xác định số lượng bản sao gen kháng Hygromycin trong cay lia Chuyén gen PP .5: Kết quả sinh trưởng của cây lúa chuyền gen Tọ trong nhà lưới.6: Kết quả sàng lọc các dòng lúa chuyền gen TTỊ,.7: Kết quả sinh trưởng của các cây lúa chuyên gen đời T¡.8: Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyên gen dựa trên độ cuốn lá.-i ¿ Ss St SE S11 115151 181811 E5EE111111515111 1111111115111 111111 11111111 xe.9: Kết quả xác định hàm lượng nước tương đối trong dòng lúa chuyên gen.10: Hàm lượng chất diệp lục a trong các dòng lúa chuyền gen.11: Hàm lượng chất diệp lục b trong các dòng lúa chuyền gen .12: Hàm lượng chất diệp lục tổng số trong các dòng lúa chuyền gen.13: Hàm lượng proline trong các dòng lÚa.14: Kết quả so sánh tương quan khả năng chịu hạn của các dòng lúa. 115 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Mạng lưới các nhân tố phiên mã tham gia đáp ứng stress hạn .2: Sơ đồ cấu trúc protein NAC.-- 2: 2-52 +++x+Ex+E2EE2E2Erxerxerxerrrree 36 Hình 1.3: Mạng lưới điều hòa phiên mã các gen đáp ứng stress phi sinh học của nhân tố phiên mã NAC ở lúa .1: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pCAM-Rd29A/OsNACI và pCAM- Lip9/OsNACÌ.2: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pBI-35§/OsNAC và pBI-Ubi/OsNACI .1: Tách chiết RNA tông số từ mẫu lúa xử lý hạn.2: Nhân bản gen OsWAC1, OsNACS va OsNAC10 bằng kỹ thuật PCR.3: Sàng lọc thể biến nạp băng PCR trực tiếp khuẩn lạc .4: Kiểm tra plasmid tái t6 hop bang PCR.

Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn .6: Phân tích trình tự axit amin suy diễn của protein OsWAC1, OsNAC5 và OsNAC10 của giống lúa Tẻ Đỏ.7: Biéu hién cua OsNACI, OsNACS va OsNACI1O trong điều kiện hạn .8: Xử lý vector pBI-Ubi, pBI-35S và pGEM/OsNACI băng enzyme cắt giới hận. HH nọ nọ re 79 Hình 3.9: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pBI-Ubi/OsNACI và pBI-35S/OsNACI 80 Hình 3.10: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pBI-Ubi/OsNACI và pBI-35S/OsNACI .11: Xử lý vector pCAM-Rd29A và pCAM-Lip9 bằng enzyme cắt giới ; 021/715 002727575.12: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pCAM-Rd29A/OsNACI và pCAM- 007/9).13: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCAM-Rd29A/OsNACI và pCAM-Lip9 /OsNACI bằng PCR và cắt giới hạn.14: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pCAM-Rd/OsNACI, pBI-35S/OsNACI, 7 pBI-Ub1/OsNACT1 và pCAM-Lip9/OsNACT.-c ch re 86 Hình 3.15: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pBI101 và pCAMBIA1301.16: Chuyén cau tric biéu hién gen ØsWAC7 vào lúa.17: Biéu hiện của OsNAC7 trong các dòng lia chuyén gen Ubi:OsNACI.18: Biéu hién cua OsNACI trong cdc dong lia chuyén gen Lip9:OsNACI .19: Đánh giá khả năng sinh trưởng của các dòng lúa chuyền gen.20: Các dòng lúa sau 2 tuần xử lý hạn.--- - 2 + 2+s+zz+x+zzxezszxees 103 Hình 3.21: Ảnh hưởng của hạn đến sự tích tụ H;O› trong lá lúa .22: Khả năng phục hồi của các dòng lúa chuyên gen và dòng đối chứng sau MO DAU 1. Dat van dé Dưới tác động của biến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy ra thường xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, là nguyên nhân chính làm giảm sản lượng cây trồng.