Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu nhân giống cây đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa) bằng phương pháp nuôi cấy phôi vô tính - Trịnh Việt Nga

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM ---------------------- TRỊNH VIỆT NGA NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY PHÔI VÔ TÍNH Chuyên ngành: Khoa học Cây trồng Mã số: 9.10 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NÔNG NGHIỆP TP. HCM - Năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM ---------------------- TRỊNH VIỆT NGA NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY PHÔI VÔ TÍNH Chuyên ngành: Khoa học Cây trồng Mã số: 9.10 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS.

Phạm Thị Minh Tâm TS. Nguyễn Hữu Hổ TP. HCM - Năm 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học mà tôi đã tiến hành và tổ chức thực hiện. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực.

Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 04 năm 2020 Tác giả luận án Trịnh Việt Nga ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa học và luận án tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS. Phạm Thị Minh Tâm và TS. Nguyễn Hữu Hổ là những người Thầy, Cô đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi thực hiện luận án. Bùi Minh Trí, TS.

Huỳnh Văn Biết, Ks. Nguyễn Đức Minh Hùng đã chỉ bảo và giúp đỡ tôi rất nhiều về chuyên môn. Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, quý Thầy Cô Phòng Đào tạo Sau Đại học và Khoa Nông học của Nhà trường đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án.

Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành được chương trình học tập. Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. Hồ Chí Minh, Công ty TNHH Khoa học và Công nghệ Khải Hoàn, bạn bè và các đồng nghiệp đã dành cho tôi nhiều sự giúp đỡ quý báu trong suốt năm năm qua.

Triệu Thị Bích, Ths. Ngô Thị Anh Khôi, Ths. Nguyễn Xuân Linh, Ths. Nguyễn Cao Kiệt, Ks.

Nguyễn Thị Hoài Thương, Ks. Trương Thị Hồng là những cộng sự đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện các thí nghiệm khoa học. Chồng, các con cùng những người thân trong gia đình đã luôn động viên tôi trong những lúc khó khăn. Ba mẹ đã hết lòng vì con.

Hồ Chí Minh ngày 24 tháng 04 năm 2020 Tác giả luận án Trịnh Việt Nga iii TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu nhân giống cây đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) bằng phương pháp nuôi cấy phôi vô tính” đã được tiến hành tại Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 4 năm 2015 đến tháng 3 năm 2019. Mục tiêu tổng quát của đề tài là xây dựng quy trình nhân giống hoàn chỉnh cây đinh lăng lá nhỏ (ĐLLN) thông qua con đường cảm ứng tạo phôi vô tính (Somatic embryo) nhằm đạt được hệ số nhân cao, chất lượng cây giống đồng nhất. Mục tiêu cụ thể gồm: (1) Xác định hàm lượng axít oleanolic của 18 mẫu giống đinh lăng và trình tự DNA barcode của 8 mẫu giống ĐLLN; (2) Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi vô tính; (3) Xác định môi trường và chế độ nuôi cấy phù hợp để cảm ứng, nhân sinh khối phôi và tạo cây hoàn chỉnh từ phôi; (4) Xác định điều kiện thuần dưỡng phù hợp đối với cây con được tạo ra từ phôi vô tính. Đề tài gồm bốn nội dung: (i) Chọn lọc dòng ĐLLN tiêu biểu và xác định đặc trưng di truyền thông qua việc đánh giá hàm lượng axít oleanolic và phân tích sử dụng chỉ thị phân tử; dòng tiêu biểu này sẽ được sử dụng làm nguồn vật liệu cho các bước nhân giống tiếp theo; (ii) Cảm ứng tạo mô sẹo, sau đó tiếp tục tái biệt hóa để tạo phôi vô tính đối với dòng ĐLLN tiêu biểu; (iii) Xác định điều kiện môi trường nuôi cấy phù hợp cho nhân nhanh sinh khối và đạt được các phôi trưởng thành của dòng ĐLLN tiêu biểu; (iv) Xác định điều kiện chăm sóc sau nuôi cấy mô cho dòng ĐLLN tiêu biểu và đánh giá sự đồng nhất di truyền của các cây con thành phẩm bằng kỹ thuật ISSR.

Kết quả phân tích ghi nhận dòng ĐLLN D7 có hàm lượng axít oleanolic cao nhất (1,18%) và có sự khác biệt di truyền so với các dòng khác thông qua kết quả phân tích HPLC và các chỉ thị DNA barcode. Mẫu phiến lá cây ĐLLN in vitro nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D ở nồng độ 2 mg/L hình thành mô sẹo tốt nhất với tỷ lệ 98,9%, đường kính mô sẹo đạt 1,9 cm, trọng lượng mô sẹo là 219,7 mg, đạt chất lượng tốt ở giai đoạn iv 40 - 50 ngày sau cấy (NSC). Mô sẹo tạo phôi vô tính tốt nhất khi được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA 1,5 mg/L và NAA 0,1 mg/L với tỷ lệ hình thành phôi đạt 80,0%, số lượng phôi đạt 549 phôi/đĩa sau 45 ngày nuôi cấy. Trên môi trường có bổ sung sucrose 40 g/L, mô sẹo phát sinh phôi tốt nhất với tỷ lệ hình thành phôi đạt 90,8%.

Phôi vô tính tăng sinh khối nhanh nhất khi nuôi cấy trong bioreactor sục khí ở dung lượng 600 mL/phút, hệ số tăng sinh phôi ở 30 NSC là 22,9 lần. Phôi vô tính đơn phát triển tốt trong môi trường 1/2 MS có bổ sung sucrose 15 g/L, adenine sulfate 10 mg/L, kinetin 0,5 mg/L, IBA 0,2 mg/L ở điều kiện nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor sục khí. Môi trường SH cho kết quả tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất: chiều cao cây đạt 2,5 cm, số lá đạt 8,9 lá/cây, số rễ đạt 7,7 rễ, chiều dài rễ là 6,2 cm, trọng lượng tươi đạt 5,9 g và trọng lượng khô đạt 0,3 g ở 8 NSC. Sau giai đoạn in vitro, cây con ĐLLN phát sinh từ phôi được lấy ra từ bình cấy mô và được trồng trên giá thể 100 % cát kết hợp che sáng trong 7 ngày đầu tiên cho sinh trưởng ổn định nhất: chiều cao cây đạt 3,04 cm, số lá trên cây đạt 5,13 lá/cây, trọng lượng trung bình cây đạt 928,3 mg/cây, tỷ lệ sống cao nhất đạt 84,4 %.

Cây phát sinh từ phôi sau khi chuyển sang trồng trong bầu chứa giá thể 1/2 mụn dừa : 1/4 tro trấu : 1/4 phân hữu cơ vi sinh kết hợp bổ sung 0,6 g N + 0,6 g P2O5/bầu + 0,3 g K2O/bầu cho cây sinh trưởng tốt, tỷ lệ xuất vườn cao nhất đạt 92,6 - 100%, chiều cao cây từ 8,9 đến 12,3 cm, có 5,4 - 7,4 lá/cây và từ 6,7 đến 8,7 rễ/cây, trọng lượng cây tươi đạt cao nhất là 20,2 - 34,3 g/cây. Kết quả đánh giá di truyền bằng kỹ thuật ISSR cho thấy các cây thành phẩm hình thành thông qua con đường phát sinh phôi vô tính đều đồng nhất về mặt di truyền so với cây mẹ. v SUMMARY The study "Multiplication of Polyscias fruticosa (L.) Harms by in vitro somatic embryo culture method" was conducted at the Institute of Tropical Biology - Ho Chi Minh City from April of 2015 to March of 2019. The general objective of the study was to establish the protocol for multiplication and acclimation of P.

fruticosa through somatic embryogenesis. The specific objectives of the study were to identify: (1) oleanolic acid content of 18 selected samples of Polycias spp. and DNA barcode of 8 selected samples of P. fruticosa;(2) the optimal culture conditions for induce callus, then re-differentiate the callus to create somatic embryos; (3) the optimal in-vitro conditions for rapid embryo multiplication and for plant regeneration; (4) optimal ex-vitro conditions for the growth of embryo-derived plantlets.

The study comprised of four contents: (i) to select the prominent P. fruticosa samples through the evaluation of oleanolic acid content and to determine genetic characteristics of the selected samples based on molecular marker analysis; The promising samples will be used as material for subsequent propagation steps; (ii) to induce callus, then re-differentiate the callus to create somatic embryos; (iii) to determine the optimal in-vitro conditions for rapid embryo multiplication and for plant regeneration; (iv) to determine optimal ex-vitro conditions for the growth of embryo-derived plantlets and to evaluate the genetic homogeneity of the plants using ISSR technique. The results obtained through the genetic evaluation showed that the matK and rbcL gene regions of the P. fruticosa samples seemed highly conserved and variation occurred in the trnH-psbA region.

Oleanolic acid content was the highest in leaf of the D7 selected sample (1,18%). The experiment on callus induction from leaf explant was carried out and recorded that the best callus induction obtained on MS medium supplemented with 2,4-D 2 mg/L, the highest callus formation rate was 98.9%, callus diameter at 1.9 cm, vi fresh weight of callus at 219.7 mg, embryogenic callus usually formed in the period of 40 - 50 days after culture (DAC). MS medium supplemented with BA 1.5 mg/L and NAA 0.1 mg/L induced the best somatic embryo with induction rate of 80.0%, number of embryos was 549 embryos per plate at 45 DAC. Medium containing sucrose 40 g/L was most effective in inducing somatic embryos with induction rate of 90.8%, number of embryos 287 per plate at 45 DAC.

The somatic embryo reached the highest biomass when cultured by using air - bubble bioreactor with aeration speed of 600 mL/minute, the embryo multiplication rate was 22.9 times at 30 DAC. Single somatic embryos regenerated on the 1/2 MS medium supplemented with sucrose 15 g/L, adenine sulfate 10 mg/L, kinetin 0.5 mg/L and IBA 0.2 mg/L both in shacked flasks and in air - bubble bioreactor. The SH medium was suitable for plant development: the plant height reached up to 2.5 cm with leaves and roots gained 8.7 per plantlets, respectively; the root length obtained 6.2 cm; the fresh weight and dry weight reached 5.3 g at 84 DAC, respectively. At the ex vitro stage, P.

fruticosa plantlets in nursery grown well on sand (100%) and shaded during the first 7 days. The plantlet reached a height of 3.0 cm, number of leaves gained 5.1 leaves/plantlet, fresh weight reached 928.3 mg/plantlet, the highest survival rate was 84. These plantlets transplanted into mixed substrate (1/2 coconut dust : 1/4 rice husk : 1/4 organic micro organism) supplemented with of 0.6 g P2O5/pot developed and gained the rate of seedlings varied from 92.6 to 100%, plantlet height varied 8.3 cm, number of leaves and roots ranged 5.7 per plantlet, respectively; the fresh weight recorded at 20. The result of the genetic evaluation by ISSR technique showed that all somatic embryo derived plants were genetically homogeneous as compared to the mother plant.

vii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan. iii Mục lục. vii Danh sách các chữ viết tắt. xi Danh sách các bảng.

xiv Danh sách các hình. xviii MỞ ĐẦU .1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .1 Giới thiệu sơ lược về cây đinh lăng.