Luận án: Lạc chuyển gen chi42 kháng héo rũ gốc mốc trắng - ĐH Khoa học Huế

ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -------***------ PHÙNG THỊ BÍCH HÕA NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH HÉO RŨ GỐC MỐC TRẮNG CỦA CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.) ĐƢỢC CHUYỂN GEN chi42 Ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 9420112 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HUẾ - 2023 Công trình đƣợc hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. Nguyễn Hoàng Lộc 2. Nguyễn Xuân Huy Phản biện 1:.

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Huế tại Đại học Huế vào hồi … giờ …, ngày … tháng … năm 20…. Có thể tìm hiểu Luận án tại: 1. Thư viện Quốc gia Việt Nam. Thư viện Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế MỞ ĐẦU 1.

Lý do chọn đề tài Lạc (Arachis hypogaea L.) là loài cây họ đậu quan trọng được trồng rộng rãi ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới để làm thực phẩm và lấy dầu. Ở Việt Nam, lạc là một trong những cây lấy dầu quan trọng nhất. Tuy nhiên, cây lạc dễ nhiễm các loại nấm bệnh, đặc biệt là nấm sinh ra trong đất, dẫn đến năng suất thấp và chất lượng hạt giống kém. Trong những năm gần đây, bệnh thối rễ và thân do Sclerotium rolfsii gây ra đã trở thành mối đe dọa lớn đối với sản xuất lạc, và đây là bệnh truyền qua đất có sức tàn phá trên toàn thế giới.

rolfsii chủ yếu gây hại phần gốc thân của cây lạc và làm cho toàn bộ cây bị héo, chết và làm giảm sản lượng lạc từ 10-80%. Một số biện pháp phòng trừ được nghiên cứu áp dụng hiện nay như thuốc hóa học, sử dụng các vi sinh vật đối kháng, luân canh cây trồng. Trong đó, tạo giống cây trồng mang các gen kháng bệnh được coi là phương thức hiệu quả và kinh tế nhất để kiểm soát bệnh và thân thiện với môi trường.14) là họ các enzyme xúc tác quá trình thủy phân các liên kết β-1,4 N-acetyl-β-D-glucosamine của chitin. Trong sản xuất nông nghiệp, chitinase là một trong những tác nhân sinh học kháng nấm bệnh ở cây trồng hiệu quả nhất.

Nhiều loài nấm Trichoderma có khả năng tiết chitinase ngoại bào nên chúng thường được sử dụng để kiểm soát các bệnh nấm hại cây trồng. Đến nay, một số gen chitinase của các chủng Trichoderma đã được tạo dòng và biểu hiện dị chủng trong một số vật chủ như Chit46 từ T. harzianum trong Pichia pastoris, Chit33 và Chit42 từ T. coli, ech42 từ T.

aureoviride trong Saccharomyces cerevisiae. Và một số gen mã hóa chitinase từ các sinh vật khác, như chitinase-3 và Rchit từ lúa hoặc chitinase từ thuốc lá đã được đưa vào cây lạc để ngăn ngừa nhiễm nấm. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có trường hợp nào biến nạp gen chitinase từ vi sinh vật vào cây lạc, đặc biệt là các loài thuộc chi Trichoderma. Vì vậy, nghiên cứu chuyển gen chitinase của Trichoderma vào cây lạc để tăng tính kháng nấm là một giải pháp hiệu quả, thân thiện với môi trường và hiện đang được quan tâm ứng dụng trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau.

Theo nghiên cứu của Loc & cs (2013), gen chitinase mã hóa chitinase 42 kDa của T. asperellum có 1 hoạt tính mạnh. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào công bố về chuyển gen chitinase mã hóa chitinase 42 kDa của T. asperellum vào cây lạc để tạo ra dòng lạc có khả năng kháng nấm.

Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng bệnh héo rũ gốc mốc trắng của cây lạc (Arachis hypogaea L.) đƣợc chuyển gen chi42”. Mục tiêu nghiên cứu Biểu hiện được gen chitinase 42 kDa trên cây lạc chuyển gen và tạo được dòng lạc chuyển gen chitinase 42 kDa có khả năng kháng nấm cao. Nội dung nghiên cứu (1) Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro giống lạc L14 (2) Sản xuất kháng thể đa dòng kháng chitinase 42 kDa ở chuột để phục vụ phân tích Western blot (3) Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật mang các gen chitinase 42 kDa (4) Biểu hiện tạm thời các gen chitinase 42 kDa trong cây Nicotiana benthamiana (5) Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên hiệu quả chuyển gen chitinase 42 kDa vào cây lạc qua trung gian A. tumefaciens (6) Nghiên cứu biến nạp các gen chitinase 42 kDa vào cây lạc thông qua A.

tumefaciens (7) Nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý và hóa sinh của các dòng lạc chuyển gen chitinase 42 kDa sinh trưởng trong điều kiện in vivo 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có tính hệ thống về tối ưu hóa gen chitinase 42 kDa để biểu hiện ở thực vật, vector chuyển gen, chuyển gen chitinase 42 kDa của T. asperellum vào cây lạc để tăng khả năng kháng bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm S.

rolfsii gây ra, đồng thời tạo ra các dòng lạc chuyển gen có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả luận án cũng là cơ sở để ứng dụng biện pháp cải thiện khả năng kháng nấm của cây lạc nhằm nâng cao năng suất và hiệu quả sản xuất lạc, góp phần bảo vệ môi trường. Đồng thời, kết quả nghiên cứu của luận án được đăng tải trên các tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước và quốc tế là tài liệu tham khảo có giá trị trong giảng dạy và nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án - Đã hoàn thiện quy trình tái sinh in vitro cho giống lạc L14: khử trùng hạt lạc bằng NaOCl 65% trong 10 phút, tái sinh các loại mẫu cấy khác nhau của cây lạc và tạo cụm chồi trên môi trường MS có bổ sung 4 mg/L BAP và 0,1 mg/L NAA, tạo rễ trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L NAA.

- Đã tối ưu hóa trình tự nucleotide gen Chi42 hoang dại mã hóa chitinase 42 kDa của T. asperellum SH16 cho biểu hiện thực vật. Hai trình tự có bộ ba tối ưu cho biểu hiện ở thực vật đã được đăng ký trên GenBank với các mã số MT083802. Đã thiết kế thành công các vector biểu hiện thực vật mang lần lượt 3 gen chitinase (Chi42, syncodChi42-1 và syncodChi42-2) dưới sự điều khiển biểu hiện của một trong hai loại promoter đặc hiệu rễ pAsy hoặc promoter thường trực dp35S.

- Đã biểu hiện và tinh sạch thành công chitinase 42 kDa ở E. Đồng thời đã sử dụng enzyme này để sản xuất thành công kháng thể đa dòng kháng chitinase 42 kDa ở chuột phục vụ cho phân tích Western blot. - Đã tiếp hợp thành công các vector biểu hiện thực vật mang các gen chitinase 42 kDa vào A. tumefaciens LBA4404 và đã biểu hiện tạm thời các gen này ở dạng hoạt động mạnh trong cây N.

benthamiana bằng kỹ thuật thấm nhập. - Đã biến nạp và tuyển chọn được 16 dòng lạc L14 mang các gen Chi42, syncodChi42-1 và syncodChi42-2 có mức độ biểu hiện chitinase cao. Sự hiện diện của các gen chitinase đã làm tăng hoạt tính kháng nấm S. rolfsii của các dòng lạc chuyển gen trong cả điều kiện in vitro và in vivo.

TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Luận án đã tham khảo và tổng quan về 4 vấn đề chính với các nội dung liên quan: (1) Bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm Sclerotium rolfsii gây ra và biện pháp phòng trừ; (2) Enzyme chitinase; (3) Nâng cao khả năng kháng nấm của cây lạc bằng kỹ thuật chuyển gen; (4) Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tăng cường khả năng kháng nấm ở cây lạc. Bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm Sclerotium rolfsii gây ra và biện pháp phòng trừ 1. Cây lạc Lạc (Arachis hypogaea L.) là một loại cây trồng có hiệu quả kinh tế cao và có giá trị đa dạng về các mặt dinh dưỡng, chăn nuôi, trồng trọt cũng như trong công nghiệp. Ở Thừa Thiên Huế, lạc cũng được xem là một trong những cây trồng quan trọng, có hiệu quả kinh tế cao.

Trong những năm gần đây, ở một số vùng sản xuất nông nghiệp của tỉnh, cây lạc chỉ đứng sau lúa và được coi là cây chủ lực có hiệu quả kinh tế cao hơn so với một số cây trồng khác. Các giống lạc được trồng chủ yếu trên địa bàn tỉnh là L14, Dù Tây Nguyên,. có thời gian sinh trưởng 120-135 ngày. Các bệnh hại do nấm gây ra ở cây lạc Các bệnh do nấm gây ra ở cây lạc chiếm số lượng lớn và mức độ nghiêm trọng hơn so với các tác nhân gây bệnh khác.

Khoảng 50 chi nấm là tác nhân gây bệnh trên cây lạc. Bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm S. rolfsii có phạm vi ký chủ rộng với hơn 500 loài thực vật, bao gồm cả cây một lá mầm và hai lá mầm. Cơ chế kháng nấm bệnh của cây lạc Cây lạc (A.) khi bị nhiễm mầm bệnh vi sinh vật, có khả năng tạo ra các hợp chất có nguồn gốc từ stilbene được coi là phytoalexin kháng nấm.

Các hợp chất Stilbenoid trong cây lạc có vai trò trong các cơ chế bảo vệ thực vật, chúng có khả năng kháng các loại nấm gây bệnh thực vật thuộc các chi Colletotrichum, Botrytis, Fusarium và Phomopsis. Tình hình nghiên cứu các biện pháp phòng trừ bệnh do S. rolfsii gây ra ở cây lạc trên thế giới và Việt Nam Để phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc trắng do S. rolfsii gây ra rất khó vì nó có phạm vi ký chủ rộng, tốc độ tăng trưởng nhanh và sản 4 xuất số lượng lớn hạch nấm, hạch nấm tồn tại dai dẳng trong đất.

Sự phân bố chitinase trong tự nhiên 1. Phân loại chitinase 1. Cơ chế phản ứng của chitinase 1. Tình hình nghiên cứu chitinase từ Trichoderma 1.

Nâng cao khả năng kháng nấm của cây lạc bằng kỹ thuật chuyển gen 1. Hệ thống vector biến nạp gen thông qua A. Promoter sử dụng trong chuyển gen thực vật 1. Tình hình nghiên cứu về promoter đặc hiệu rễ 1.

Thay đổi mã di truyền của gen đích cho phù hợp với hệ thống biểu hiện 1. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tăng cƣờng khả năng kháng nấm ở cây lạc 1. Hệ thống tái sinh và quy trình chuyển gen ở cây lạc 1. Tình hình nghiên cứu chuyển gen chitinase vào cây lạc nhằm nâng cao khả năng kháng nấm Các gen mã hóa chitinase có khả năng kháng nấm bệnh đã được chú ý ở nhiều loài cây trồng khác nhau nhưng ở cây lạc vẫn còn ít.

Những nghiên cứu trong nước theo hướng biểu hiện gen chitinase ngoại lai ở cây trồng chưa được công bố nhiều. Hiệu quả chuyển gen chỉ được đánh giá ở mức độ lai Southern, các phân tích biểu hiện gen ở mức độ phân tử cũng như ở điều kiện in vivo chưa được thực hiện. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. Nguyên liệu nghiên cứu 2.