Nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh loét trên cây chanh của cao chiết phân đoạn từ cây giao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM  NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN Xanthomonas sp. GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY CHANH CỦA HOẠT CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ CÂY GIAO (Euphorbia tirucalli L.) Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 9.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 4/2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM  NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN Xanthomonas sp. GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY CHANH CỦA HOẠT CHẤT CHIẾT CHIẾT XUẤT TỪ CÂY GIAO (Euphorbia tirucalli L.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Võ Thị Thu Oanh PGS.

Trần Thị Lệ Minh Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 4/2022 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận án, tôi đã nhận được sự quan tâm tạo điều kiện, chỉ bảo, giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn chân thành nhất, cho phép tôi xin được gửi lời cảm ơn đến: Ban Giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu tại trường. Ban Giám hiệu Trường Đại Học Công nghiệp Thực phẩm Tp.

Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Thủy sản đã hỗ trợ, tạo điều kiện về thời gian để tôi có thể học tập và hoàn thành luận án. Ban Chủ nhiệm Bộ môn và Quý thầy cô trong khoa Khoa học Sinh học, Quý thầy cô bộ môn Bảo vệ thực vật Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Võ Thị Thu Oanh, Bộ môn Bảo vệ thực vật và PGS.

Trần Thị Lệ Minh, khoa Khoa học Sinh học Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Xin gửi lời biết ơn chân thành nhất tới Ba, Mẹ đã luôn lo lắng, cổ vũ, ủng hộ tinh thần cho con trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án. Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè và anh chị em đồng nghiệp đã hỗ trợ tôi trong thời gian học tập và hoàn thành luận án.

Thủ Đức, tháng 04 năm 2022 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Mỹ Lệ I LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Võ Thị Thu Oanh và PGS. Trần Thị Lệ Minh tại trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

Số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực đã được công bố trong các tạp chí, hội nghị khoa học bởi tác giả, nhóm tác giả, cộng tác viên và chưa được ai công bố. Tác giả luận án Nguyễn Thị Mỹ Lệ II TÓM TẮT Luận án “Nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh loét trên cây chanh của cao chiết phân đoạn từ cây Giao (Euphorbia tirucalli L.)” được tiến hành từ tháng 7/2017 đến tháng 6/2021. Luận án nghiên cứu các nội dung tuần tự từ xác định loài vi khuẩn Xanthomonas sp.

gây bệnh loét trên cây chanh không hạt (Citrus latifolia) và chanh giấy (Citrus aurantiifolia) theo phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái có kiểm chứng theo quy trình Koch’s sau phân lập; tiến hành các đặc điểm sinh hóa và sử dụng kỹ thuật phân tử dựa trên trình tự các vùng gene 16S rDNA, hrpW, pthA để so sánh; xác định các nhóm hợp chất, hàm lượng hoạt chất có trong cao chiết từ cây giao; xác định nồng độ và đánh giá hiệu quả ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. của dịch chiết từ cây giao trong điều kiện in vitro, nhà lưới và ngoài đồng. Bảy mươi lăm mẫu phân lập từ vết bệnh loét trên lá, cành và quả chanh trồng tại Bến Lức, Thạnh Hóa và Đức Huệ tỉnh Long An đều có các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh hóa của loài vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. Trình tự vùng gene 16S rDNA của 9 mẫu phân lập Xanthomonas axonopodis trong nghiên cứu có độ tương đồng cao từ 94 ÷ 99%; vùng gene hrpW và pthA tương đồng 100% với loài vi khuẩn X.

citri trên cơ sở dữ liệu Genebank với hệ số bootstrap 1.000 lần lặp lại. Trình tự 3 vùng gen của vi khuẩn X. citri trong nghiên cứu đã được đưa vào cơ sở dữ liệu Genebank. Cao phân đoạn ethyl acetate (EA) từ dịch chiết cây giao có sự hiện diện của các nhóm hợp chất alkaloid, flavonoid, tannin, terpenoid nhiều nhất và không có sự hiện diện của nhóm saponin.

Hàm lượng phenolic và flavonoid thu được trong cao chiết EA là cao nhất tương ứng 106,32 mgGAE/g và 450,83 μgQE/g cao chiết. Ở nồng độ 0,75%, khả năng ức chế vi khuẩn X. citri của cao chiết EA rất cao với đường kính vòng vô khuẩn lớn 17,67mm. Kết quả phân lập các hợp chất trong cao phân đoạn EA cho thấy có sự hiện diện của các chất scopoletin, gallic acid và piperic acid với hàm lượng lần lượt 21,81 mg/g cao chiết, 14,86 mg/g cao chiết và 13,52 mg/g cao chiết và đều có hoạt tính ức chế vi khuẩn X.

citri gây bệnh loét trên cây chanh. Trong đó, hợp chất piperic acid là một chất mới thu nhận được trong dịch III chiết từ cây giao ở Bình Thuận. Trong điều kiện nhà lưới, nghiệm thức xử lý dịch chiết cao EA nồng độ 1,0% ức chế tốt sự lan truyền của vi khuẩn X. axonopodis trong tế bào thực vật, với kích thước vết bệnh nhỏ nhất 0,91 mm, nhỏ hơn so với đối chứng 1,9 mm và hiệu quả giảm bệnh đạt cao nhất 67,84% sau 3 lần xử lý.

Ngoài đồng, sử dụng dịch chiết EA ở nồng độ 1,25% để trừ bệnh loét trên cây chanh cho hiệu quả giảm bệnh trên lá là 63,75%, trên quả là 61,29% và hiệu quả kéo dài đến 21 ngày sau xử lý. Từ khóa: Bệnh loét, Cây giao, Chanh không hạt, Dịch chiết, Xanthomonas axonopodis pv. IV SUMMARY The dissertation “Research on inhibition capacity of Euphorbia tirucalli fraction extract against Xanthomonas sp. causing citrus canker on lime trees” was conducted from July 2017 to June 2021.

The research contents of the dissertation include identification of Xanthomonas sp. causing citrus canker disease on Persian lime (Citrus latifolia) and Key lime (Citrus aurantiifolia) using traditional method based on verified morphological characteristics in accordance with Koch's postulates; determination of biochemical characteristics of the bacterial species and comparison of biochemical characteristics by 16S rDNA, hrpW, pthA gene-based molecular technique; determination of compound groups, content of active ingredient in Euphorbia tirucalli extract; determination of inhibitory concentrations and evaluation of inhibitory effect againts Xanthomonas sp. of Euphorbia tirucalli extracts under in vitro, greenhouse and natural conditions. 75 samples isolated from canker sores on leaves, branches and fruits of lemon trees grown in Ben Luc, Thanh Hoa and Duc Hue (Long An province) all showed the morphological and biochemical characteristics of Xanthomonas axonopodis pv.

The 16S rDNA gene sequences of nine different isolates have a high similarity level of 94-99%; the hrpW and pthA gene sequences are homologous to those of X. citri available in GeneBank with bootstrap values of 1000 repititions. The ethyl acetate (EA) fraction of Euphorbia tirucalli extract contains alkaloids, flavonoids, tannins, terpenoids, but not saponins. The phenolic and flavonoid contents were found in EA extracts at the highest levels of 106,32 mgGAE/g and 450,83 μgQE/g, respectively.

At a concentration of 0.75%, the ability to inhibit X. citri of the EA extracts was very high with inhibitory zone diameter of 17. Scopoletin, gallic acid, and piperic acid found in the EA fraction had concentrations of 21.52 mg/g, respectively, and all had antibacterial activity against X. citri causing canker disease on lime trees.

Among those, piperic acid is a new compound obtained from extracts of Euphorbia tirucalli grown in Binh Thuan province. Under the greenhouse condition, the experiment with EA extract at a concentration of 1% showed a good inhibitory effect on X. citri with the smallest disease zone of 0.91mm, smaller than the control sample of 1.9 mm and the effiency of disease reduction at 67.84% after 3 times of treatment. Under V natural conditions, using the EA extract at a concentration of 1.25% to control the cankers in lime revealed a disease reduction of 63.75% in leaf and 61.29% in fruit, and its effective time was 21 days after treatment.

Từ khóa: Canker disease, Euphorbia tirucalli L., Seedless lemon, Extract, Xanthomonas axonopodis pv. VI MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN. I LỜI CAM ĐOAN.IV MỤC LỤC.V DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.VI DANH SÁCH CÁC BẢNG.IVII DANH SÁCH CÁC HÌNH.VIII MỞ ĐẦU. 1 Tính cấp thiết của luận án.1 Mục tiêu của luận án.

2 Ý nghĩa khoa học của luận án.2 Ý nghĩa thực tiễn của luận án.2 Đối tượng nghiên cứu của luận án.2 Những đóng góp mới của luận án.2 CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tổng quan về cây chanh. Vị trí phân loại. Đặc điểm thực vật.

Tình hình sản xuất chanh ở Long An. Tổng quan về bệnh loét do vi khuẩn trên cây chanh. Lịch sử và phân bố. Triệu chứng bệnh và thiệt hại về kinh tế.

Nguồn bệnh và điều kiện phát sinh bệnh. Các dạng bệnh loét do vi khuẩn trên cây chanh. Biện pháp phòng trừ. Tổng quan về vi khuẩn Xanthomonas axonopodis gây bệnh loét trên cây chanh.

Vị trí phân loại. Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa. Đặc điểm di truyền của vi khuẩn Xanthomonas axonopodis. Vai trò vùng rDNA-ITS.

Giới thiệu về các gene gây bệnh. Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới và trong nước về vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri và bệnh loét do vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri trên cây có múi 22 1.

Tổng quan về cây giao (Euphorbia tirucalli L. Phân loại thực vật. Đặc điểm thực vật. Nguồn gốc và phân bố.

Thành phần hóa học của cây giao (E. Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng của dịch chiết cây giao (E. Tổng quan về hợp chất thứ cấp phenolic. Tính chất kháng khuẩn của các hợp chất phenolic.33 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu.

Phân lập và xác định loài vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh loét trên cây chanh theo hình thái, đặc điểm sinh hóa, trình tự vùng 16S rDNA, hrpW và pthA. Xác định loài vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh theo hình thái và đặc tính sinh hóa35 2.2 Xác định loài vi khuẩn Xanthomonas sp.

dựa vào trình tự vùng 16S rDNA, hrpW và pthA. Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. của cao chiết phân đoạn từ cây giao trong điều kiện in vitro. Xác định độ ẩm của mẫu bột cây giao.

Xác định hợp chất trong cao phân đoạn có hoạt tính ức chế vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. Xác định hàm lượng các hợp chất có trong cao chiết phân đoạn có hoạt tính ức chế vi khuẩn X. axonopodis cao nhất. Đánh giá hiệu quả đối với bệnh loét do vi khuẩn X.