Luận án tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu chế phẩm vi sinh vật bản địa phòng trừ nấm hại rễ hồ tiêu tại Đắk Lắk - Phạm Thị Thúy Hoài

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẠM THỊ THÚY HOÀI NGHIÊN CỨU VÀ SỬ DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT BẢN ĐỊA ĐỐI KHÁNG VỚI MỘT SỐ NẤM GÂY HẠI RỄ CÂY HỒ TIÊU TẠI ĐĂK LẮK LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2020 i luan an VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẠM THỊ THÚY HOÀI NGHIÊN CỨU VÀ SỬ DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT BẢN ĐỊA ĐỐI KHÁNG VỚI MỘT SỐ NẤM GÂY HẠI RỄ CÂY HỒ TIÊU TẠI ĐĂK LẮK Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Phạm Việt Cường Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung 2. Trần Đình Mấn Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2020 ii luan an LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, tôi xin gửi lời biết ơn chân thành nhất tới PGS.TS Phạm Việt Cƣờng, Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung, Viện Hàn lâm KH và CN Việt Nam đã hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Trần Đính Mấn, Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH và CN Việt Nam đã tận tính hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể các anh chị và các bạn đồng nghiệp phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điền kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài này. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung; PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc – Viện Hóa Sinh Biển; các anh chị em và các bạn đồng nghiệp trung tâm Khoa học và Công Nghệ Quảng Trị, phòng Công nghệ sinh học, trung tâm Sinh học phân tử Nghĩa Đô - Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung và ThS. Bùi Thị Hải Hà - Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, hợp tác và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án này. Đây là công trính đƣợc thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí của đề tài độc lập cấp Nhà nƣớc, thuộc chƣơng trính Tây Nguyên 3: “Nghiên cứu hoàn thiện và chuyển giao công nghệ sản xuất sản phẩm sinh học POLYFA-TN3 góp phần cải tạo đất cho vùng Tây Nguyê” với mã số đề tài: TN3/C10.

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đính, ngƣời thân và bạn bè, những ngƣời luôn bên tôi, quan tâm, động viên, tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành nhiệm vụ đƣợc giao. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 NCS. Phạm Thị Thúy Hoài iii luan an LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trính nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả NCS.

Phạm Thị Thúy Hoài iv luan an MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN. i LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC VIẾT TẮT.

vi DANH MỤC BẢNG BIỂU. viii DANH MỤC HÌNH. ix MỞ ĐẦU. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.

TỔNG QUAN VỀ HỒ TIÊU. Cây hồ tiêu. Tính hính sản xuất và tiêu thụ trên thế giới. Tính hính sản xuất và tiêu thụ ở Việt Nam.

Một số bệnh hại chính trên cây hồ tiêu. Vi sinh vật đối kháng nấm bệnh trên cây hồ tiêu. VAI TRÒ CỦA CÁC VI SINH VẬT TRONG ĐẤT TRỒNG HỒ TIÊU. ĐÁNH GIÁ KHU HỆ VI SINH VẬT BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS.

TÌNH HÌNH ỨNG DỤNG CÁC CHẾ PHẨM VI SINH VẬT TRONG. PHÒNG TRỪ BỆNH TRÊN HỒ TIÊU. 27 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.

Vật liệu phân tìch metagenome trong đất vùng rễ cây hồ tiêu khu vực bị. bệnh và không bị bệnh. Vật liệu tạo nguồn gene vi sinh vật phục vụ nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ lên men các chủng vi sinh vật nghiên cứu.

Vật liệu bố trí thí nghiệm xây dựng mô hình sử dụng sản phẩm nghiên cứu trên đất trồng hồ tiêu. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phƣơng pháp phân tìch metagenome trong đất vùng rễ cây hồ tiêu khu…. vực bị bệnh và không bị bệnh.

Phƣơng pháp tạo nguồn gene vi sinh vật phục vụ nghiên cứu. Phƣơng pháp nghiên cứu hoàn thiện quy trính công nghệ lên men các chủng vi sinh vật nghiên cứu. Phƣơng pháp bố trì thì nghiệm xây dựng mô hính sử dụng sản phẩm nghiên cứu trên đất trồng hồ tiêu. Phƣơng pháp xử lý số liệu.

44 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. PHÂN TÍCH METAGENOME TRONG ĐẤT VÙNG RỄ HỒ TIÊU. KHU VỰC BỊ BỆNH VÀ KHÔNG BỊ BỆNH TẠI ĐĂK LĂK. Tạo cơ sở dữ liệu 18S rRNA metagenome từ mẫu đất.

Thành phần và tỷ lệ eukaryote (sinh vật nhân chuẩn) trong hai mẫu đất trồng hồ tiêu. Thành phần vi nấm trong đất trồng tiêu. Thành phần loài đƣợc phân loại trong giới phụ Stramenopiles có trong đất trồng tiêu. Một số nấm gây bệnh và nấm đối kháng với nấm gây bệnh hồ tiêu trong hai mẫu đất nghiên cứu.

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng từ vùng sinh thái ở Đắk Lắk. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử định danh các chủng vi sinh vật có hoạt tình cao đƣợc tuyển chọn làm chế phẩm vi sinh vật. NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ vi luan an PHẨM VI SINH VẬT GỐC.

Xác định thời gian bảo quản. Đánh giá độ an toàn của sản phẩm. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ BỆNH HẠI CÂY HỒ TIÊU VÙNG TÂY NGUYÊN CỦA CHẾ PHẨM VI SINH VẬT BẢN ĐỊA. Hiệu quả phân POLYFA-TN3 đối với hồ tiêu.

Đánh giá hiệu quả phân POLYFA-TN3 đối với hồ tiêu trên quy mô 1ha. 83 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. PHÂN TÍCH METAGENOME TRONG ĐẤT VÙNG RỄ HỒ TIÊU KHU VỰC BỊ BỆNH VÀ KHÔNG BỊ BỆNH TẠI ĐĂK LĂK. TẠO NGUỒN GENE VI SINH VẬT PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT.

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT GỐC. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ BỆNH HẠI CÂY HỒ TIÊU CỦA CHẾ PHẨM VI SINH VẬT BẢN ĐỊA. 98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 103 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ TRONG THỜI GIAN THỰC HIỆN LUẬN ÁN.

105 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH. TÀI LIỆU THAM KHẢO. 112 PHỤ LỤC vii luan an DANH MỤC VIẾT TẮT EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid IAA Indole-3-acetic acid BVTV Bảo vệ thực vật CT Công thức Ctv Cộng tác viên Cs Cộng sự D1 Đất bị bệnh D2 Đất không bị bệnh Đ/c Đối chứng HCN Hydrogene cyanide IMOs Indigenous Microorganisms IPC International Pepper Community HCBVTV Hóa chất bảo vệ thực vật MIC Minimal inhibitory concentration MTC Maximal tolerance concentration Nấm AM Arbuscular mycorrhizal fungus Ops Organophosphates OPH Organophosphorus hydrolase OUT Operational Taxonomic Units (Đơn vị phân loại) PIMG Percent inhibition of mycelial growth PL Phụ lục SAR systemic acquiredresistance SDS Sodium dodecyl sulfate VSV Vi sinh vật Tag Đơn vị gene đƣợc xác định hay nhãn xác định trình tự biểu hiện Trp Tryptophan viii luan an WASI The Western Highlands Agro-Forestry Scientific and Technical Institute VPA The Vietnam Pepper Association ix luan an DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bệnh và sâu hại chủ yếu trên hồ tiêu ở Việt Nam .2 Một số vi sinh vật đối kháng bệnh hại hồ tiêu .1 Cặp mồi sử dụng cho PCR khuếch đại gene 16S rRNA vi khuẩn .2 Thành phần PCR khuếch đại gene 16S rRNA .3 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp.1 Thành phần và tỷ lệ (%) các chi nấm chiếm ƣu thế so với Eukaryote tổng số trong hai mẫu đất vƣờn tiêu tại Đăk Lăk .2 Thành phần và tỷ lệ (%) các loài nấm so với Eukaryote tổng số trong hai mẫu đất vƣờn tiêu tại Đăk Lăk.3 Thành phần và tỷ lệ (%) các chi Stramenopiles chiếm ƣu thế so với Eukaryote tổng số trong hai mẫu đất vƣờn tiêu tại Đăk Lăk .4 Thành phần và tỷ lệ (%) các loài thuộc giới phụ Stramenopiles xác định đƣợc trong hai mẫu đất tiêu .5 Thành phần và tỷ lệ (%) các loài thuộc giới phụ Stramenopiles xác định đƣợc chỉ có trong mẫu D1và không bị bệnh .6 Hoạt tình đối kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập .7 Hoạt tình đối kháng nấm bệnh của các chủng xạ khuẩn phân lập .8 Hoạt tình đối kháng nấm bệnh của các chủng vi nấm phân lập .9 Hoạt tính sinh học của các chủng sử dụng sản xuất chế phẩm .10 Xác định tình đối kháng giữa các chủng vi sinh vật tuyển chọn.11 Mật độ các chủng vi sinh vật theo thời gian bảo quản (CFU/g) .12 Hoạt tính sinh học của chế phẩm vi sinh vật theo thời gian bảo quản .13 Tỷ lệ các bệnh chủ yếu trên vƣờn hồ tiêu trong thời gian thí nghiệm (%) .14 Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất và năng suất hồ tiêu .15 Tác động của POLYFA-TN3 tới năng suất và trọng lƣợng hồ tiêu .16 Tác động của POLYFA-TN3 tới tỷ lệ các bệnh chính trên hồ tiêu .17 Hiệu quả kinh tế khi bón phân POLYFA-TN3 cho hồ tiêu. 83 x luan an DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Vƣờn hồ tiêu .2 Hồ tiêu và các đối tƣợng gây hại trên tiêu .3 Hồ tiêu, rễ và lá bị chết nhanh .4 Bệnh chết chậm và suy giảm chậm trên hồ tiêu do tác nhân nấm và tuyến trùng gây ra .5 Triệu chứng lá bị bệnh thán thƣ .1 Sơ đồ quy trình sử dụng các công cụ tin sinh học trong phân tích metagenome của các mẫu đất nghiên cứu .1 Kết quả điện di ADN tổng số tách chiết từ hai mẫu đất nghiên cứu.

Mẫu đƣợc điện di với thể tích 5l trong thời gian 30 phút ở điện thế 100V .2 Phân tích thống kê các tag và số lƣợng OTUs của hai mẫu đất phân tích .3 Biểu đồ Krona biểu thị thành phần và tỷ lệ các giới sinh vật trong mẫu đất trồng hồ tiêu bị bệnh tại Đăk Lăk (mẫu D1) .