Luận án phát triển dòng Dó bầu đặc sắc - ĐH Nông Lâm TP.HCM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ************** ĐINH TRUNG CHÁNH NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC DÒNG DÓ BẦU (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) ĐẶC SẮC Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Thành Phố Hồ Chí Minh - Năm 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ************** ĐINH TRUNG CHÁNH NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC DÒNG DÓ BẦU (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) ĐẶC SẮC Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Kỹ thuật Lâm sinh Mã số: 62 62 60 01 Người hướng dẫn khoa học: 1. Bùi Cách Tuyến Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 03/2010 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Đinh Trung Chánh iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và trân trọng đến PGS Tiến sĩ Trần Văn Minh và PGS Tiến sĩ Bùi Cách Tuyến đã nhận hướng dẫn khoa học cho luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn GS Tiến sĩ Bùi Chí Bửu và GS Tiến sĩ Nguyễn Thị Lang đã giúp đỡ trong việc áp dụng phương pháp khảo sát đa dạng di truyền. Tôi xin trân trọng cám ơn Viện Công Nghệ sinh học và Môi trường Đại học Nông Lâm TP.

Hồ Chí Minh, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long trong việc giúp đỡ và tạo điều kiện cho việc tiến hành các thí nghiệm. Xin trân trọng cảm ơn Vườn Quốc gia Phú Quốc, Chi cục Kiểm Lâm Quảng Nam, Ủy Ban Dân tộc Miền núi, Trung tâm Khảo sát Thiết kế Nông nghiệp tỉnh Khánh Hòa, Chi cục Kiểm Lâm An Giang và Thảo Cầm Viên TP. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ trong các cuộc khảo sát thực tế. HCM, ngày 15 tháng 3 năm 2010 Đinh Trung Chánh iv TÓM TẮT Trong Luận án này, chúng tôi trình bày: (1) kết quả khảo sát trên hiện trường và các thí nghiệm trong phòng cũng như trên thực địa nhằm tìm hiểu đặc điểm của những cây Dó bầu (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) đang có trầm; (2) ứng dụng di truyền học phân tử để khảo sát đa dạng dưới loài; (3) ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, phát sinh phôi soma và tạo hạt giống nhân tạo để nhân nhanh giống cây Dó bầu từ các cá thể cây mẹ có trầm; (4) thăm dò khả năng kích thích tạo trầm bằng các biện pháp vi sinh và hóa học.

Phần tổng quan đã dựa vào nhiều nguồn tài liệu tham khảo, nhấn mạnh rằng giá trị cao của gỗ trầm là một động lực dẫn tới sự khai thác quá mức và sự cạn kiệt của các loài cây này trong rừng tự nhiên. Nhưng nông dân các tỉnh được khảo sát từ Quảng Nam trở vào cho đến đảo Phú Quốc đã đáp ứng với tình hình khan hiếm các sản phẩm trầm bằng các kỹ thuật trồng, quản lý, kích thích tạo trầm và khai thác trầm một cách đa dạng. Một số kỹ thuật dân gian để kích thích sự tạo trầm đã được ghi nhận. Nghiên cứu đa dạng dưới loài được thực hiện với hai phương pháp sinh học phân tử: phản ứng PCR-RAPD và giải trình tự chuỗi DNA.

Sử dụng phản ứng PCR-RAPD trên 12 mẫu cá thể cây Dó bầu thí nghiệm từ các xuất xứ gần nhau và trong quần thể cho thấy các mẫu được chia thành 5 nhóm chính, phản ánh sự đa dạng dưới loài của các mẫu Dó bầu được khảo sát. Kết quả nghiên cứu trình tự DNA của bốn xuất xứ Dó bầu khác nhau cũng đã củng cố cho kết luận về đa dạng dưới loài từ phương pháp PCR. Mẫu vật thu thập từ những cây Dó bầu có dấu hiệu tạo trầm được sử dụng cho các thí nghiệm nuôi cấy mô qua hai bước chính: (1) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và (2) nuôi cấy phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo. Các thí nghiệm nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tập trung vào việc xác định môi trường thích hợp, tác dụng của sự bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng cũng như các điều kiện vật lý ảnh hưởng lên sự vi nhân giống in-vitro từ đỉnh sinh trưởng.

Môi trường WPM tỏ ra tốt hơn môi trường MS cho việc nuôi cấy. So sánh các vật liệu nguồn từ Bắc đảo Phú Quốc v (BD1 và BD2) và từ Nam đảo Phú Quốc (ND1 và ND2) cho thấy xuất xứ này có ảnh hưởng lên sự hình thành và phát triển chồi in-vitro. Các thí nghiệm nuôi cấy tế bào soma được thiết kế liên hoàn nhằm dẫn tới việc sản xuất "hạt giống nhân tạo" có thể sử dụng thuận tiện trong việc nhân nuôi cây con thay cho hạt giống thực sinh. Việc nuôi cấy phát sinh tế bào phôi soma từ các mẫu lá và rễ trên môi trường cơ bản MS bổ sung BA, kinetin, NAA, IBA, 2,4D, vitamin B5 cho thấy tỷ lệ phát sinh tế bào soma cao với mẫu nuôi cấy là rễ (dòng ND, nam đảo Phú Quốc).

Sau khi có phôi soma, thí nghiệm nhân sinh khối dịch huyền phù phôi soma được tiến hành trên môi trường nuôi cấy có agar, nhân sinh khối trên môi trường lỏng và sau đó tái sinh phôi soma. Thể giả phôi (PLB), một dạng thuận lợi cho sự vi nhân giống, được chuyên hóa bằng cách bổ sung kích thích tố. "Hạt giống nhân tạo" được thực hiện với natri alginat và calci clorua trên môi trường WPM bổ sung sucrose. Natri alginat 4% cho một độ đông đặc thỏa đáng và không ảnh hưởng bất lợi lên sự tái sinh.

Sinh trưởng của cây con sau nuôi cấy trong ống nghiệm được theo dõi ở vườn ươm trong 12 tháng. Sự khác biệt về sinh trưởng của cây con từ bốn xuất xứ ND1, ND2, BD1, BD2 là không có ý nghĩa, nhưng bề rộng lá từ ND1 và ND2 nhỏ hơn từ BD1, BD2. Sự phân lập nấm trên các mô có dấu hiệu hình thành trầm đã cho phép xác định một tập đoàn gồm 10 loài nấm khác nhau hiện diện trong các mô gỗ được khảo sát. Một số chi nấm được xác định tương đồng với một số công trình gần đây.

Từ đó, thí nghiệm thăm dò kích thích tạo trầm với bảy nghiệm thức (vi sinh và hóa học) trên ba địa điểm: Đại Lãnh (Nha Trang), Thảo Cầm Viên (TP. Hồ Chí Minh) và Vĩnh Long đã được thực hiện. Kết quả không hoàn toàn đồng nhất ở ba địa điểm này mặc dù xử lý bằng clorua (Cl-) mang lại tác dụng cao ở hai trong ba địa điểm và cũng được xếp hạng cao nhất. Xử lý bằng nấm đen và nitrat (NO-3) cho kết quả đứng thứ hai ở Đại Lãnh và Thảo Cầm Viên và thứ nhất ở Vĩnh Long.

vi SUMMARY This thesis presents findings from field studies, laboratory and in situ experiments on the characteristics of Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte (eagle- wood) and the application of plant cell technologies to propagate specific clones of this endangered species of Vietnam. Besides, explorative experiments on the inducement of eagle-wood formation from planted trees of this species were also performed. A review of litteratures was performed, focusing on the characteristics of the species and a wide range of utilization and market value of eagle-wood and its derivatives in Asia. The studies on formation of eagle-wood in the nature and in controlled experiments were also reviewed.

The high value of eagle-wood and its products has been the main motivation of its over-exploitation, and leading to depletion of the species in natural forests. However, field studies conducted in various provinces in the natural area of the species from Quảng Nam to Phú Quốc shown a positive trend of planting Aquilaria and inducing eagle-wood formation initiated by farmers. PCR-RAPD and DNA sequencing were used to explore the intraspecific diversity. High similarity values (0.0) were obtained from a test with 18 samples, which can be grouped into 5 clusters, relecting the provenances of the samples.

DNA sequencing was also performed on 4 samples and chains of both DNA and proteins were elaborated. Distance analyses shown the possibility of grouping the samples based on DNA chain was better than those based on protein sequences. Materials collected during the field visits in North and South Phú Quốc Island from Aquilaria trees having indications of eaglewood formation were used in micro-propagation experiments. Two set of experiments were conducted, meristematic and somatic cell cultures, to find appropriate techniques and conditions.

The meristematic culture experiments aim to determine suitable medium, the addition of growth regulators and the physical condition affecting in vii vitro propagation and development of plantets. The somatic cell culture experiments were designed according to a schemee that leads to the production of "artificial seeds", i. a form of culture embedding in organic polymers to be conveniently used as natural seed substitues. In meristematic culture, WPM was found better than MS medium.

The addition of BA (0.1 mg/l) and NAA (0.1 mg/l) was found suitable for protocorm formation, while the supplementation of CW was found giving a high rate of differentiation. A combination of BA (0.1 mg/l) and BA (0.1 mg/l) gave better shoot elongation of the plantets in-vitro. Besides, a high light intensity (54.72 μmol/m2/s), combined with good aeration is required for the growth and development of the cultures. A comparison of the stocks, including two from North Phu Quoc Island (BD1 and BD2) and two from South Phu Quoc Island (ND1 and ND2), shown that provenances influences the variations of shoot formation and growth in-vitro.

Somatic cell cultures were performed with leaf and root tissues on MS medium with the supplementation of BA, Ki, NAA, IBA, 2,4D, and vitamine B5. Root tissues from ND stock gave good results. Somatic cells developed rapidly in media supplemented with 2,4-D, while in media with BA + NAA + Ki + vitamine B5 the somatic cells had a milky white color. Somatic cell suspensions were multiplied in liquid media or in media gelatinized with agar-agar and somatic embryos were regenerated.

PLB, a convenient form for micropropagation, can be differentiated by the supplementation of BA (5mg/l) + NAA (0.2 mg/l) or Ki (3 mg/l) + NAA (0.2 mg/l) and the results were better than BA or Ki alone. Artificial seed production experiments were performed with sodium alginat and the "seeds" were regenerated with sodium chloride on WPM with the addition of sucrose. Sodium alginate at 4% was found giving an adequate consistency, but a higher concentration can give harmful effect on regeneration. The growth of the seedlings from micropropagated plantets were monitored up to 12 months.

The differences of growth performances of plantets from 4 stocks viii ND1, ND2, BD1, BD2 were found non-significant but leaf widths of the plantet from ND1 and ND2 stocks were smaller than from BD1, BD2. Ten (10) fungi species were isolated and identified in the samples of infected wood. Certain similarity between our results and fungi recorded by previous authors were recognized.