Luận án chế tạo β-glucan khối lượng phân tử thấp tan trong nước từ bã men bia bằng bức xạ gamma Co-60

TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma Co-60 để chế tạo β-glucan khối lượng phân tử thấp tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã men bia” được thực hiện từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2019 tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh và Viện Sinh học Nhiệt đới. Mục tiêu của đề tài là hoàn thiện quy trình thu nhận chế phẩm β-glucan từ bã thải nấm men bia của nhà máy sản xuất bia; xác định được cấu trúc đặc trưng c ng như một số đặc tính hiệu ứng sinh học in vitro và in vivo của chế phẩm β-glucan sau khi chiếu xạ; và thiết lập được quy trình công nghệ tạo chế phẩm β-glucan tan trong nước có Mw thấp phù hợp cho mục đích ứng dụng làm thực phẩm chức năng và chế phẩm bổ sung trong chăn nuôi. Để đạt được mục tiêu nói trên, đề tài tiến hành thực hiện 4 nội dung nghiên cứu như sau: (1) Tách chiết β-glucan từ bã tế bào nấm men bia; (2) Cắt mạch β- glucan bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma Co-60; (3) Xác định hoạt tính sinh học của β-glucan cắt mạch bằng phương pháp chiếu xạ; (4) Hoàn thiện quy trình chế tạo β-glucan có Mw thấp và tan nước bằng phương pháp chiếu xạ. Nội dung 1 gồm các thí nghiệm thu nhận thành tế bào nấm men bia phục vụ tách chiết β-glucan tổng số và xác định các đặc trưng cấu trúc của mẫu β-glucan sau khi tách chiết.

Nội dung 2 với các thí nghiệm chiếu xạ tạo mẫu β-glucan Mw thấp tan trong nước ở các liều xạ khác nhau phục vụ xác định hiệu suất β-glucan Mw thấp tan trong nước tạo thành c ng như các đặc trưng cấu trúc của mẫu sau khi chiếu xạ. Nội dung 3 gồm các thí nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học in vitro (hoạt tính kháng oxi hoá) và in vivo trên chuột (giải độc gan, hạ lipid và glucose máu, tăng cường yếu tố miễn dịch) và trên gà (tăng trọng và tăng cường miễn dịch). Nội dung 4 với các thì nghiệm chiếu xạ mẫu β-glucan ở các điều kiện pH khác nhau và ứng dụng hiệu ứng cộng hợp (kết hợp xử lý với H2O2) c ng như xác định hiệu suất các đặc trưng cấu trúc nhằm xây dựng quy trình chế tạo β-glucan tan nước có Mw thấp phù hợp và có hoạt tính sinh học cao bằng phương pháp chiếu xạ. Với các nội dung nói trên, kết quả đạt được của đề tài có thể tóm tắt như sau: - Đã hoàn thiện quy trình tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men từ bã men bia với sản phẩm β-glucan có độ tinh khiết cao (đạt khoảng 91,8%), có Mw > 64 kDa và có đặc trưng cấu trúc hầu như không khác biệt so với mẫu chuẩn cùng dạng của hãng Sigma.

xiii - Đã chế tạo được β-glucan tan nước có Mw thấp từ 11 - 50 kDa bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60. Việc gia tăng độ pH của mẫu β-glucan, đặc biệt khi xử lý kết hợp với 1% H2O2 đã làm gia tăng mạnh hiệu quả cắt mạch. Kết quả phân tích phổ FTIR, XRD và cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy các mẫu β- glucan tan nước có Mw thấp chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ có đặc trưng cấu hầu như không khác biệt so với mẫu β-glucan ban đầu. - β-glucan chiếu xạ có Mw thấp và tan nước có hoạt tính kháng oxi hoá cao và β-glucan có Mw càng thấp thì hoạt tính kháng oxi hoá càng cao.

- Kết quả thử nghiệm trên chuột cho thấy β-glucan chiếu xạ đã có khả năng bảo vệ gan chuột được gây độc gan bằng CCl4 (chỉ số AST và ALT trong máu chuột cho uống chế phẩm đều có xu hướng giảm dần khi Mw của β-glucan giảm) và chuột cho uống β-glucan có Mw thấp và tan nước có Mw~25 kDa đã giảm 68% chỉ số AST và 48% ALT so với chuột gây độc gan chỉ cho uống nước cất. Bên cạnh đó, chế phẩm này còn có tác dụng gia tăng gia số lượng bạch cầu tổng số, bạch cầu trung tính và lympho bào c ng như yếu tố miễn dịch dịch thể IgG và IgM. Ngoài ra kết quả thử nghiệm trên chuột béo phì c ng cho thấy β-glucan có Mw~25 kDa là thích hợp cho mục đích làm giảm mỡ máu với khả năng làm giảm 38% lượng cholesterol tổng số, 33% triglyceride, 39% lượng LDL và 34% lượng glucose sau thử nghiệm 20 ngày. Các chỉ số này tiếp tục giảm khi kéo dài quá trình thử nghiệm lên tới 40 ngày.

Sau 20 ngày ngừng sử dụng chế phẩm, hiệu quả của chế phẩm vẫn khá cao với mức giảm 38% lượng cholesterol tổng số, 41% triglyceride, 40% lượng LDL và 36% lượng glucose trong máu chuột. - Ở gà, khi cho ăn bổ sung chế phẩm β-glucan chiếu xạ có Mw thấp đã có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng, gia tăng tỷ lệ nuôi sống và hoạt tính miễn dịch ở gà. So với đối chứng, β-glucan có Mw~25 kDa đã có hiệu ứng tối ưu về mức độ tăng trọng bình quân (tăng 23,63%); tỷ lệ nuôi sống (tăng 54,5%) và gia tăng chất lượng quầy thịt, bạch cầu tổng số, tỷ lệ bạch cầu trung tính và lympho bào; tăng hiệu giá kháng thể kháng bệnh gumboro, bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm và bệnh newcastle. - Đã xây dựng thành công quy trình chế tạo chế phẩm β-glucan tan trong nước có Mw ~25 kDa và có hoạt tính sinh học cao bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp xử lý H2O2.

Chế phẩm β-glucan Mw thấp tan trong nước chế tạo từ quy trình nói trên xiv hứa hẹn là hoạt chất bổ sung tốt, hiệu quả, an toàn và đáp ứng nhu cầu nuôi gà sạch không sử dụng kháng sinh c ng như có triển vọng ứng dụng cao cho mục đích làm thực phẩm chức năng nhằm tăng cường miễn dịch c ng như hỗ trợ điều trị các bệnh mỡ máu, chống oxi hóa và giải độc gan. xv SUMMAY The Thesis entitled “Study on the application of gamma Co-60 irradiation for preparation of bioactive water-soluble low molecular weight β-glucan product from spent brewer’s yeast” has been carried out at Biotechnology Center of Ho Chi Minh City and Institute of Tropical Biology from 11/2015 to 5/2019. The aim of the thesis is to improve the process for preparation of β-glucan product from spent brewer’s yeast; to evaluate the structural characteristics and the in vitro and in vivo biological activities of radiation degraded β-glucan samples; and to build up the process for producing the water-soluble low molecular weight (Mw) β-glucan product with a suitable Mw for application as functional food and additive feed. This study consists of 4 contents such as: (1) Extraction of β-glucans from spent brewer’s yeast; (2) Degradation of β-glucans by gamma Co-60 irradiation method; (3) Investigation of biological activities of radiation-degraded β-glucans; and (4) built-up of the process for producing the water-soluble low Mw β-glucans product by irradiation method.

The fist covers studies on collection of Saccharomyces yeast cell walls for extraction of β-glucans and characterization of the structural properties of extracted β-glucans product. The second includes the experiments of preparation of water-soluble low Mw β-glucan by irradiation at various doses in order to determine the water-soluble yields and structural characteristics of irradiated samples. The third involves bioactivity tests in vitro condition (antioxidant activity) and in vivo on mice (the hepatoprotective, reduction of blood lipid and glucose and immune-stimulation activity) and on broiler (the weight gain and immune-stimulation activity). The fourth describes the experiments for determination of the water-soluble yields and structural characteristics of samples irradiated at various pH conditions and in combination with H2O2 (synergic effect) aiming to build up the process for producing the water-soluble low Mw β- glucan product by irradiation method.

With the above research contents, the obtained results in this dissertation can be summaried as bellow: - The process for extraction of β-glucans from spent brewer’s yeast was successfully improved to produce β-glucans product with high purity (91.8 β-glucan xvi in content), Mw > 64 kDa and its structural characteristics almost the same as those of the standard β-glucans from Simma Ltd. - The low Mw (11 - 50 kDa) and water-soluble β-glucans were successfully prepared by gamma Co-60 irradiation method. The increase of pH conditions, especially, the combined treatment with 1% H2O2 strongly enhanced the degradation yield. The results from FTIR, XRD and NMR spectra indicated that the structural characters of water-soluble low Mw β-glucans prepared by irradiation method were also most similar to those of unirradiated β-glucan.

- The water-soluble low Mw β-glucan showed a high antioxidant activity by radical DPPH and the lower Mw of water-soluble β-glucan displayed the higher antioxidant activity. - The results from test on mine demonstrated that the irradiated β-glucan showed high hepatoprotective activities in CCl4-induced hepatotoxic mice (the decrease of ALT (Alanine-aminotransferase) and AST (Aspartate-aminotransferase) indexes in blood of the tested mice were directly proportional to the decrease of Mw of the supplemented irradiated β-glucans. The supplementation of water-soluble β- glucan with Mw~25 kDa remarkably reduced AST (68%) and ALT (48%) indexes in blood of CCl4-induced hepatotoxic mice compared to those in blood of mice induced hepatotoxic supplied with only distilled water. On the other hand, the supplementation of this water-soluble low Mw β-glucan also caused a significantly increase both of cellular immunity indexes (total white blood cells, the rates of neutrophil and lymphocyte) and human immunity indexes (IgG and IgM) in blood of tested mice.

In addition to, the test on obese induced mice also pointed out that the water-soluble β-glucan with Mw~25 kDa decreased the levels of total cholesterol (38%), triglyceride (33%), LDL-cholesterol (39%) and glucose (34%) in blood of tested mice after 20 days of administration. These indexes were further reduced after 40 days of administration with the water-soluble low Mw β-glucan product. Furthermore, after stopping supplementing with water-soluble low Mw β- glucan, total cholesterol, triglyceride, LDL-cholesterol and glucose in blood of tested mice were still lower than those in blood of the unsupplemmented control ones about 38, 41 and 41%, respectively. xvii - In broiler, the supplementation with irradiated β-glucan with low Mw enhanced the growth prmotion, suvival rate and immune activities.

The supplementation with water-soluble β-glucan with Mw~25 kDa not only increased the average body weight (23.5%) and quality of meat but also stimulated the enhacement of cellular immunity indexes (total white blood cells, the rates of neutrophil and lymphocyte) and specific immune components (antibodies related to anti-newcastle disease virus, anti-infectious bursal disease virus and anti- infectious bronchitis virus). - The process for producting the water-soluble β-glucan product with Mw~25 kDa and high bio-acivity by irradiation incombination with H2O2 method was successfully built up. The water-soluble low Mw β-glucan product prepared by this process is promising additive feed for production of clean chicken meat without antibiotic and promising ingredient that can be used in nutraceutical food for therapeutics of diabetic, dyslipidemia and hematoprotective as well. xviii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Trong hơn hai mươi năm qua, β-glucan đã được nghiên cứu về các tác dụng sinh học có lợi đối với động vật có vú và người.