Luận án tiến sĩ: Khảo sát thành phần hóa học cây ích mẫu, ngải cứu và trắc bách diệp

Ích mẫu (Leonurus japonicus) thuộc họ Lamiaceae, phân bố rộng khắp Việt Nam. Cây mọc hoang ở vùng ẩm ướt, ven đường, bờ ruộng. Trong y học cổ truyền, ích mẫu được dùng điều kinh, lợi tiểu, hoạt huyết. Phần trên mặt đất của cây chứa nhiều hoạt chất sinh học. Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện alkaloid, flavonoid trong cây ích mẫu. Thành phần hóa học dược liệu này còn có diterpenoid và phenolic. Hoạt tính sinh học đáng chú ý gồm kháng viêm, chống oxy hóa, bảo vệ tim mạch.

Ngải cứu (Artemisia vulgaris) là cây thuốc Nam quen thuộc trong đời sống. Cây thuộc họ Asteraceae, mọc nhiều ở miền Bắc và Trung Việt Nam. Lá ngải cứu có mùi thơm đặc trưng do tinh dầu. Y học dân gian dùng ngải cứu trị cảm lạnh, đau bụng, chống côn trùng. Phytochemical screening cho thấy ngải cứu chứa sesquiterpenoid, flavonoid, coumarin. Tinh dầu ngải cứu giàu camphor, eucalyptol, borneol. Nghiên cứu hiện đại xác nhận tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của cây.

Trắc bách diệp (Biota orientalis) là cây gỗ thuộc họ Cupressaceae. Cây được trồng làm cảnh và lấy lá làm thuốc. Lá trắc bách diệp có vị đắng, tính hàn theo y học cổ truyền. Công dụng chính là cầm máu, mát gan, giảm ho. Thành phần hóa học bao gồm diterpenoid, biflavonoid, polysaccharide. Tinh dầu từ lá chứa các monoterpen và sesquiterpen. Hoạt tính sinh học gồm kháng ung thư, chống viêm, bảo vệ gan thận.

Nguyên liệu thực vật được làm sạch, sấy khô ở 50°C. Mẫu khô được nghiền thành bột mịn. Chiết xuất thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 3-5 ngày. Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1:10 (w/v). Dịch chiết được lọc, cô quay thu cao. Cao chiết được hòa tan trong nước rồi chiết phân bố. Các phân đoạn n-hexan, ethyl acetat, n-butanol được thu riêng. Sắc ký cột silica gel 60 (70-230 mesh) dùng để tách chất. Gradient dung môi từ n-hexan đến methanol. Sắc ký HPLC pha đảo dùng cho tinh chế cuối.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được đo trên máy Bruker 500 MHz. Phổ 1H-NMR, 13C-NMR cung cấp thông tin về khung carbon-hydro. Phổ 2D gồm HSQC, HMBC, COSY, NOESY xác định liên kết. Dung môi deuterat thường dùng là CDCl3, CD3OD, DMSO-d6. Khối phổ HRESIMS xác định công thức phân tử chính xác. Phổ hồng ngoại IR cho biết nhóm chức đặc trưng. Góc quay cực [α]D đo trên polarimeter. Điểm nóng chảy được xác định bằng máy Melting Point.

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được thử trên các dòng KB, LU-1, Hep-G2. Phương pháp MTT assay đo khả năng sống của tế bào. Giá trị IC50 biểu thị nồng độ ức chế 50% tế bào. Hoạt tính ức chế α-glucosidase đánh giá tiềm năng chống đái tháo đường. Phương pháp đo quang so màu với chất chuẩn acarbose. Hoạt tính ức chế acetylcholinesterase liên quan đến bệnh Alzheimer. Phương pháp Ellman dùng DTNB làm thuốc thử. Chất chuẩn dương galantamin được dùng để so sánh.

Diterpenoid labdan là nhóm hợp chất thứ cấp đặc trưng của ích mẫu. Khung carbon gồm 20 nguyên tử sắp xếp theo kiểu labdan. Vị trí C-7 thường mang nhóm carbonyl (C=O). Vị trí C-8 có liên kết đôi C=C. Một số hợp chất có vòng epoxy tại C-15, C-16. Nhóm hydroxyl (-OH) xuất hiện ở C-13, C-15. Phổ 1H-NMR cho tín hiệu proton olefin ở δ 5.5-6.0 ppm. Phổ 13C-NMR hiện tín hiệu carbonyl ở δ 200-210 ppm. Phổ HMBC xác định liên kết carbon-proton xa 2-3 nối.

Hợp chất IM107 có công thức phân tử C20H32O4 từ HRESIMS. Phổ IR cho peak hấp thụ nhóm OH ở 3420 cm⁻¹, C=O ở 1710 cm⁻¹. Phổ 1H-NMR hiện 4 tín hiệu methyl tại δ 0.80-1.20 ppm. Proton olefin H-9 xuất hiện ở δ 5.68 ppm. Phổ 13C-NMR cho 20 tín hiệu carbon phù hợp CTPT. Carbon carbonyl C-7 cộng hưởng ở δ 202.5 ppm. Phổ HSQC xác định tương quan trực tiếp C-H. Phổ HMBC thiết lập khung carbon labdan. Cấu trúc vòng epoxy được xác nhận qua NOESY.

Hợp chất IM117 là steroid có khung ergostane. Công thức phân tử C29H48O được xác định bằng HRESIMS. Phổ 1H-NMR cho tín hiệu 6 nhóm methyl. Proton olefin H-4 cộng hưởng ở δ 5.72 ppm. Phổ 13C-NMR hiện 29 tín hiệu carbon. Carbon carbonyl C-3 xuất hiện ở δ 199.8 ppm. Liên kết đôi C4-C5 được xác nhận qua HSQC, HMBC. So sánh dữ liệu phổ với tài liệu xác định cấu trúc stigmast-4-en-3-on. Đây là steroid thường gặp trong thực vật.

Hợp chất NC58 có công thức phân tử C15H24O4. Khung carbon sesquiterpen eudesman gồm 15 carbon. Phổ 1H-NMR cho 3 tín hiệu methyl, 2 methine mang oxy. Proton olefin H-3 xuất hiện ở δ 5.45 ppm. Phổ 13C-NMR hiện tín hiệu acid carboxylic ở δ 178.2 ppm. Hai carbon mang hydroxyl cộng hưởng ở δ 72.5 và 68.3 ppm. Phổ HMBC xác định vị trí nhóm chức trên khung eudesman. Phổ NOESY thiết lập cấu hình tương đối các trung tâm bất đối. Cấu trúc này chưa được báo cáo từ nguồn tự nhiên.

Hợp chất NC64 thuộc nhóm flavon có nhiều nhóm methoxy. Công thức phân tử C18H16O7 từ phân tích HRESIMS. Phổ 1H-NMR cho tín hiệu 3 nhóm methoxy ở δ 3.80-3.95 ppm. Proton H-3 của flavon xuất hiện ở δ 6.68 ppm. Vòng A có 1 proton H-8 ở δ 6.52 ppm. Vòng B cho 3 proton thơm ở δ 7.20-7.65 ppm. Phổ 13C-NMR hiện 18 tín hiệu carbon thơm và methoxy. Carbon carbonyl C-4 cộng hưởng ở δ 182.5 ppm. Phổ HMBC xác định vị trí gắn các nhóm methoxy và hydroxyl.

Sesquiterpenoid NC58 là đại diện mới cho nhóm eudesmanoid. Cấu trúc có 2 hydroxyl và 1 acid carboxylic tăng tính phân cực. Hợp chất này có thể tham gia vào hoạt tính sinh học của ngải cứu. Flavonoid NC64 với nhiều nhóm methoxy có tính ưa béo cao. Các flavonoid đa methoxy thường có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Kết quả phân lập làm phong phú thêm cơ sở dữ liệu phytochemical screening. Hai hợp chất này đặc trưng cho thành phần hóa học dược liệu ngải cứu.

Hợp chất TBD9 có công thức phân tử C18H28O3. Khung carbon labdan bị mất 2 carbon tại C-15, C-16. Phổ 1H-NMR cho tín hiệu 2 proton olefin ngoại vòng ở δ 4.85, 4.78 ppm. Nhóm methyl H-17 xuất hiện ở δ 1.68 ppm. Phổ 13C-NMR hiện acid carboxylic C-19 ở δ 180.5 ppm. Carbon carbonyl C-13 cộng hưởng ở δ 215.8 ppm. Liên kết đôi ngoại vòng C8-C17 được xác nhận qua HMBC. Phổ HSQC thiết lập tương quan trực tiếp C-H. Cấu trúc này đặc trưng cho diterpenoid từ họ Cupressaceae.

Acid trans-cinnamic (TBD74) có công thức C9H8O2. Liên kết đôi C=C ở cấu hình trans với J = 16 Hz. Phổ 1H-NMR cho 5 proton thơm và 2 proton olefin. Acid trans-ferulic (TBD75) có thêm nhóm methoxy và hydroxyl trên vòng benzene. Hợp chất TBD76 là este của acid ferulic với alcohol bậc 1 mạch dài. Phổ 1H-NMR hiện tín hiệu methylene (-CH2-)n ở δ 1.25 ppm. Số carbon của mạch alcohol là 22 (docosyl). Phổ 13C-NMR xác nhận este carbonyl ở δ 167.5 ppm.

Hợp chất TBD73 có công thức phân tử C18H16O7. Khung flavon với carbonyl tại C-4. Vòng A có hydroxyl tại C-7 và methoxy tại C-5, C-6. Vòng B có methoxy tại C-4'. Phổ 1H-NMR cho 3 tín hiệu methoxy ở δ 3.82-3.90 ppm. Proton H-3 của flavon ở δ 6.65 ppm. Hydroxyl phenolic C-7 cho tín hiệu rộng ở δ 12.8 ppm. Phổ 13C-NMR hiện 18 carbon thơm và methoxy. Phổ HMBC xác định vị trí các nhóm thế trên 2 vòng benzene. So sánh với NC64 cho thấy sự khác biệt vị trí methoxy.

Thử nghiệm được thực hiện bằng phương pháp MTT assay. Ba dòng tế bào ung thư gồm KB (miệng), LU-1 (phổi), Hep-G2 (gan). Nồng độ thử từ 1-100 μg/mL trong 48 giờ. Diterpenoid IM107 cho IC50 = 25.3 μM trên dòng KB. Hợp chất IM102 có IC50 = 32.8 μM trên LU-1. Steroid IM117 thể hiện hoạt tính yếu (IC50 > 50 μM). Chất chuẩn ellipticin có IC50 = 0.8-1.2 μM. Kết quả cho thấy hoạt tính trung bình của các diterpenoid. Cần nghiên cứu thêm về cơ chế tác dụng.

Enzym α-glucosidase tham gia phân giải carbohydrate thành glucose. Ức chế enzym này giúp kiểm soát đường huyết sau ăn. Phương pháp đo quang với cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside. Flavonoid NC64 cho IC50 = 45.2 μM. Hợp chất TBD73 có IC50 = 52.8 μM. Chất chuẩn acarbose có IC50 = 38.5 μM. Flavonoid đa methoxy thể hiện tiềm năng chống đái tháo đường. Kết quả phù hợp với công dụng truyền thống của ngải cứu, trắc bách diệp.

Enzym AChE phân giải acetylcholine tại synapse thần kinh. Ức chế AChE tăng nồng độ acetylcholine, cải thiện trí nhớ. Phương pháp Ellman dùng DTNB làm thuốc thử màu. Sesquiterpenoid NC58 cho IC50 = 15.8 μM. Diterpenoid TBD9 có IC50 = 28.5 μM. Chất chuẩn galantamin có IC50 = 2.3 μM. Hợp chất NC58 có hoạt tính đáng chú ý. Kết quả mở ra hướng nghiên cứu tiềm năng chống Alzheimer. Cần thử nghiệm in vivo để khẳng định hiệu quả.