Luận án TS Lê Thị Thu Phương: Phân tích trình tự ORF2 PCV2 và nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh heo

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ THU PHƯƠNG PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ORF2 CỦA PCV2 TỪ HEO NUÔI Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM VÀ NGHIÊN CỨU VẮC-XIN PHÒNG BỆNH LIÊN QUAN PCV2 TRÊN HEO SAU CAI SỮA Chuyên ngành: Bệnh lý học và Chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.02 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS. Nguyễn Ngọc Hải TS. Nguyễn Thị Thu Hồng TP.

Hồ Chí Minh – tháng 11 năm 2019 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan những công bố trong luận án này là trung thực, một phần dữ liệu là công trình nghiên cứu của tôi chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác, một phần dữ liệu trong luận án thuộc đề tài độc lập trong chương trình nhiệm vụ nghiên cứu đặc thù, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đặt hàng theo công văn số 2151/BNN-KHCN ngày 21/4/2011 và theo hợp đồng số 23 HĐ/TC- KHCN giữa Văn phòng Bộ NN-PTNN và Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y – Công ty TNHHMTV Thuốc Thú Y Trung Ương – NAVETCO ngày 07/6/2011 do TS. Nguyễn Thị Thu Hồng làm chủ nhiệm. Những số liệu trong luận án được phép công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài và cơ quan chủ trì. Tác giả Lê Thị Thu Phương iii LỜI CẢM ƠN Xin thành kính biết ơn công lao sinh thành dưỡng dục đến Ba Má.

Xin thành kính ghi ơn PGS. Nguyễn Ngọc Hải và TS. Nguyễn Thị Thu Hồng đã hết lòng hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình công tác, học tập, thực hiện và hoàn thành luận án này. Xin chân thành cảm ơn PGS.

Nguyễn Tất Toàn, PGS. Lâm Thị Thu Hương, PGS. Nguyễn Văn Khanh, TS. Hồ Thị Kim Hoa, PGS.

Lê Thanh Hiền, PGS. Trần Thị Dân, PGS. Nguyễn Ngọc Tuân đã động viên và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh Đạo Công ty Cổ phần Thuốc Thú Y Trung Ương NAVETCO, BLĐ Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y đã đồng ý và tạo điều kiện về thời gian, cơ sở vật chất để tôi được học tập, nghiên cứu thực hiện và hoàn thành luận án này.

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm và quý Thầy Cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y, Phòng đạo tạo sau đại học đã giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cũng như những hỗ trợ khác để tôi hoàn thành khóa học. Xin chân thành cảm ơn Ông Chris. Morrissy và Ông Darren Schafer thuộc phòng thí nghiệm Australian Animal Health Laboratory – CSIRO, đã cung cấp một số sinh phẩm trong nghiên cứu này. Xin chân thành cảm ơn Anh Đặng Hùng, Chị Lam Hương và các bạn đồng nghiệp Ngọc Ánh, Nhị Hà, Vô Ngôn, Hồng Phúc, Tấn Liêm, Hào Quang, Thu Lâm, Minh Hải ở Trung Tâm Nghiên Cứu, bạn Kim Phúc và anh Hải, Chị Thu Hà, Chị Diệu Thúy, Em Thanh Phong đã đồng hành và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài.

Xin gởi lời cảm ơn và lời yêu thương chân thành đến đại gia đình đã ủng hộ, động viên tôi trong công tác, học tập và hoàn thành luận án. iv TÓM TẮT Đề tài “Phân tích trình tự ORF2 của PCV2 từ heo nuôi ở một số tỉnh phía Nam và nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa” được thực hiện nhằm xác định genotype và đánh giá sự tương đồng di truyền của PCV2 lưu hành tại một số tỉnh phía Nam Việt Nam và nghiên cứu thử nghiệm vắc- xin phòng hội chứng còi, giảm lượng vi-rút huyết trong mô và bệnh tích liên quan PCV2 trên heo dựa trên chủng phân lập trong nghiên cứu. Kết quả đạt được như sau: Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên toàn bộ ORF2 của 48 mẫu PCV2 thu thập từ năm 2007 đến 2016 từ 44 trại heo ở 13 tỉnh thành Việt Nam (gồm 12 tỉnh phía Nam và 1 tỉnh Bắc Trung Bộ) cho thấy, có sự lưu hành đồng thời PCV2b, PCV2d và PCV2-Re (2h) (trước đây được xếp vào nhóm PCV2 tái tổ hợp, theo cách phân loại mới được xếp vào genotype PCV2h), trong đó phổ biến nhất là PCV2b (24/48). Sự xuất hiện và ngày càng trở nên phổ biến của genotype PCV2d, đặc biệt là PCV2d- 2 (15/16 mẫu thuộc PCV2d) từ năm 2012 trở đi.

Mức độ tương đồng về nucleotide ở mỗi genotype tương ứng 98,7% - 100% đối với PCV2b, 98,5 - 100% đối với PCV2d- 2 và PCV2-Re (2h) là 98,7 - 100%. Khoảng cách di truyền (p - distance) giữa các genotype khá cao, từ 0,0595  0,0096 đến 0,0663  0,0102, cao hơn rất nhiều so với ngưỡng p = 0,035. Đã phân lập được 18 chủng PCV2 thuộc các genotype PCV2b (9 chủng), PCV2d (6 chủng) và PCV2-Re (2h) (3 chủng) từ 21 mẫu bệnh phẩm dương tính PCV2 - thu nhận từ heo có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích bệnh do circovirus. Hiệu giá vi-rút đạt được trên môi trường tế bào PK15A dao động từ 1,67 đến 5,50log10 TCID50/ml ở lần tiếp đời thứ 3.

Ba chủng thuộc 3 genotype khác nhau có hiệu giá cao ổn định qua các lần tiếp đời (≥ 5,0log10 TCID50/ml): NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) được sử dụng để lựa chọn làm giống gốc nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh do circovirus trên heo. Đánh giá sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PCV2 thuộc các genotype khác nhau bằng phản ứng trung hòa chéo. Kết quả cho thấy giữa chủng NAVET- v DongNai2/2009 và NAVET-vietnam3/2004 tương đồng hoàn toàn về kháng nguyên với hệ số R là 104,20%. Hệ số R giữa chủng NAVET-DongNai2/2009 và chủng NAVET- LongAn2/2012; giữa NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 tương ứng là 91,60% và 91,30%, tất cả đều > 70%.

Qua đây cho thấy, cả 3 chủng này tuy khác nhau về genotype nhưng tương đồng với nhau về kháng nguyên. Từ các kết quả nghiên cứu về đặc tính di truyền, nuôi cấy trên tế bào, tương đồng kháng nguyên cho thấy, chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) đáp ứng đầy đủ các tiêu chí để được chọn làm giống gốc trong nghiên cứu sản xuất vắc-xin. Sử dụng binary ethylenimine (BEI) để bất hoạt vi-rút chế tạo kháng nguyên PCV2, với nồng độ BEI 3 mM, ở nhiệt độ 370C, sau 24 giờ có thể vô hoạt hoàn toàn các vi-rút thuộc các chủng NAVET-vietnam3/2004, NAVET-DongNai2/2009 và NAVET-LongAn2/2012, với tốc độ bất hoạt tương ứng với các chủng lần lượt là 0,71; 0,86 và 1,33log10 TCID50/giờ. Đánh giá hiệu lực của vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm từ chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b).

Thí nghiệm 3: lúc 4 tuần tuổi, heo ở lô thí nghiệm (n = 6) được tiêm vắc-xin thử nghiệm (2 ml/ liều, chứa lượng kháng nguyên 106,0TCID50) và sử dụng dịch chiết tế bào PK15A trên lô đối chứng (n = 4). Sau tiêm vắc-xin 28 ngày, tất cả heo được công cường độc bằng cách nhỏ mũi 2 ml và tiêm bắp 2 ml với vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 ở tiếp đời thứ 6 với hiệu giá 5,33log10TCID50/ml. Ở lô thí nghiệm, heo có sự chuyển đổi kháng thể ở 14 - 21 ngày sau tiêm vắc-xin. Heo sau tiêm vắc-xin và công cường độc đều khỏe mạnh, tăng trọng bình thường, có thời gian vi-rút huyết ngắn, bài thải vi-rút qua phân và dịch tiết mũi với tỉ lệ thấp hơn so với heo đối chứng.

Tỉ lệ heo mắc PMWS trên lô vắc-xin là 0/6 và ở lô đối chứng là 1/4. Kết quả cho thấy vắc-xin vô hoạt nhũ dầu này có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch cũng như bảo hộ heo về mặt lâm sàng chống lại PCV2b, giảm tỉ lệ heo có vi-rút huyết và giảm hiệu giá vi-rút trong mô lúc 28 ngày sau công cường độc. vi SUMMARY The study “Genetic analysis of PCV2-ORF2 from pigs in Southern Vietnam and study on vaccine against porcine circovirus diseases in post-weaning pigs” was carried out from June 2012 to June 2018, in Veterinary Research Center – NAVETCO National Veterinary Joint Stock Company, Nong Lam University Ho Chi Minh City. The aims were to determine the prevalence of PCV2 genotypes, genetic homology of PCV2 isolates circulating in Southern of Vietnam and research on vaccine against porcine circovirus in post-weaning pigs based on PCV2 isolates in this study.

Full-length ORF2 of 48 PCV2 isolates from 44 pig farms in 13 provinces in Vietnam (including 12 Southern and 1 North Central Coast provinces) between 2007 and 2016 was analysed nucleotide sequence. The results showed that genotype PCV2b, PCV2d and PCV2-Re (2h) (formerly classified as recombinant cluster) co- existed, of which the most prevalent genotype was PCV2b (24/48). PCV2d genotype was emergent and predominant, especially PCV2d-2 (15/16) from 2012 onwards. Nucleotide homology for each genotype was 98.5 - 100% for PCV2d-2 and 98.7 - 100% for PCV2-Re (2h).

p - distance among genotypes were quite high and range from 0. Eighteen PCV2 strains were isolated from the PCV2 PCR positive samples, belonged to genotype PCV2b (9 strains), PCV2d (6 strains) and PCV2-Re (2h) (3 strains). The viral titer of PCV2 isolates at the third passages in PK15A cells was in the ranges from 1.50log10 TCID50/ml. Three PCV2 field strains, which the viral titers were stably high (≥ 5.0log10 TCID50/ml) through passages, belonged to different genotypes, namely NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET- LongAn2/2012 (PCV2d) and NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)), were selected as master seed for studying of PCV2 vaccines.

Applying cross neutralization test and R value (cross-reactivity value) to determine antigenic diversity of PCV2 strains. The R value obtained by cross neutralization test between NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-vietnam3/2004 was 104.20%; NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-LongAn2/2012; NAVET- vii LongAn2/2012 and NAVET-vietnam3/2004 were 91. These results indicated that no antigenic differences were found among these strains (R > 70%). Using binary ethylenimine (BEI) to inactivate virus for producing PCV2 antigen, BEI at 3 mM, 370C after 24 hours was able to inactivate completely NAVET- vietnam3/2004, NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-LongAn2/2012 strains with inactivation rates 0.33log10 TCID50 per hour, respectively.

Efficacy of experimental inactivated oil emulsion PCV2 vaccine based on NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) strain: Experiment 3: at 4 weeks of age, vaccine group (n = 6) were vaccinated with the experimental PCV2 vaccine (2 ml/dose, contains 106.0TCID50) by intramuscular route, and control group (n = 4) were injected with 2 ml of PK15A cell extract. After 4 weeks post-vaccination, the vaccinated together with unvaccinated controls were challenged intranasally and intramuscularly with 4x105,33TCID50 of NAVET-DongNai2/2009 strain, and observed for 28 days post challenge. The seroconversion started at 14 - 21 dpv in vaccinated pigs. The vaccinated pigs had no increase in body temperature, without any clinical signs during the experiment.

The obtained results indicated that this vaccine induced immunological responses in vaccinated pigs that appeared to provide clinically protective against PCV2b infection. Viremia, shedding and viral load in tissues were reduced in vaccinated pigs compared to controls. viii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa .i Lời cam đoan .ii Lời cảm ơn. iii Tóm tắt/Summary.iv Mục lục.

viii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt. xii Danh mục các bảng .xv Danh mục các hình, biểu đồ và sơ đồ. xvii Mở đầu. Giới thiệu về PCV2.

Phân loại PCV2 .